Редактирование генов. Панацея или ящик Пандоры? Часть 1

Редактирование генов. Панацея или ящик Пандоры? Часть 1

В первой части мы расскажем, как работает одна из самых популярных на сегодня систем редактирования генома и какие у нее есть побочные эффекты.
 463 •
  0
23.09.2019
Иллюстрация Георгия Сапего

Автор: С.В. Попов, заведующий отделом неинвазивной пренатальной диагностики «Медикал Геномикс», PhD

Как работает редактирование генома на основе CRISPR-Cas систем

Технологии редактирования генома на основе CRISPR-Cas систем в современном мире постоянно развиваются. Тем не менее, одними из наиболее популярных систем остаются инструменты, основанные на комбинации белка Cas9 и короткой направляющей (гидовой) РНК. CRISPR-Cas9 комплекс связывается с геномной ДНК в том месте, где последовательность нуклеотидов совпадает с последовательностью гидовой РНК. Таким образом, создавая различные варианты последовательности гидовой РНК, можно направлять Cas9 к тому участку, который необходимо отредактировать. Дальше возможны различные варианты, например, когда Cas9 разрезает обе нити ДНК в нужном месте, после чего системы репарации пытаются устранить двуцепочечный разрыв, используя гомологичный фрагмент ДНК в качестве матрицы для восстановления поврежденного участка, либо в клетку вводится искусственно созданная матрица, для того чтобы добиться нужных изменений в редактируемой последовательности.

Другой подход заключается в использовании техники, называемой базовым редактированием. Базовые редакторы (редакторы оснований) представляют собой отключенный (мутантный) Cas9 с ферментом, который может преобразовывать один нуклеотид ДНК в другой. Отключенный Cas9 направляет базовый редактор на сайт в геноме, где он химически напрямую изменяет ДНК, а не делает разрыв. Исследования, опубликованные в апреле этого года, показали, что некоторые из этих базовых редакторов склонны вносить нецелевые изменения, но продолжается работа по повышению их точности (1).

Побочные эффекты при редактировании генома

Необходимо обратить особое внимание на побочные эффекты, возникающие в процессе работы с этими инструментами редактирования.

Один из них – так называемый эффект «оффтаргетинга». Под ним подразумевается большое количество ошибок, которые возникают в процессе «залечивания» двуцепочечных разрывов. Белок Cas9 работает, как молекулярные «ножницы». Гидовая РНК связывается с ДНК последовательностью, которая примыкает к особой последовательности protospacer adjacent motif (PAM) (2). Но существуют много сайтов в геноме, которые несут те же самые буквы (последовательности нуклеотидов), что и РАМ. Таким образом, Cas9, распознавая PAM, может приводить к ошибочному разрезу ДНК не в том месте. Это явление и называется оффтаргетингом, то есть действием вне мишени. Такие «нецелевые» действия эндонуклеаз, в частности Cas9, могут привести к проблемам со здоровьем: например, изменение гена, который подавляет рост опухоли, может привести к опухолевой прогрессии и раку.

В настоящее время исследователи ведут разработки по поиску альтернативы ферменту Cas9, который может быть менее подвержен ошибкам. Параллельно идет работа по повышению специфичности гидовых РНК.

Частота ошибок варьирует в зависимости от того, на какой сайт в геноме нацелены редактирующие системы. И многие из ферментов, редактирующих гены, были изучены только на мышах или человеческих клетках, выращенных в культуре, а не на человеческих эмбрионах. Частота ошибок может различаться у мышей и клеток человека, а также у зрелых клеток и эмбрионов.

Более серьезной проблемой, чем нецелевые эффекты, могут быть изменения ДНК, которые являются целевыми, но нежелательными. После того, как Cas9 или подобный фермент разрезает ДНК, клетка сама решает, как ей лучше залечить повреждение. Но процессы восстановления клетки непредсказуемы.

Одна из форм восстановления называется негомологичным соединением концов. В этом случае часто удаляются некоторые нуклеотиды ДНК в месте разреза. Данный процесс может быть полезен, если целью редактирования является отключение экспрессии мутантного гена.

                                                      Иллюстрация Георгия Сапего

Другая форма восстановления структуры ДНК называется гомологичной рекомбинацией. Она позволяет исследователям переписать последовательность ДНК, предоставив шаблон в виде второго неповрежденного аллеля, который копируется в месте разреза. После того как Cas9 разрезает ДНК, клетка запускает процессы репарации. Сценарий, по которому клетка будет репарировать себя, заранее непредсказуем. Это либо процесс негомологичного соединения концов, либо гомологичная рекомбинация. Как уже отмечалось выше, исследователь может сам вводить донорскую ДНК в качестве здоровой матрицы для гомологичной рекомбинации. Этот процесс более точный, но менее эффективный. Его можно использовать для коррекции такого заболевания как муковисцидоз, который обычно вызывается короткими делециями в гене CFTR.

Оба этих механизма репарации сложно контролировать. Делеции, вызванные негомологичным соединением концов, могут различаться по размеру, образуя разные последовательности ДНК. Гомологичное восстановление дает больший контроль над процессом редактирования, но оно происходит с гораздо меньшей частотой (3).

Все эти побочные эффекты, а также возможные побочные эффекты, о которых мы пока не знаем, значительно затрудняют эксперименты по редактированию генома людей. Тем не менее, такие исследования проводятся. О них мы расскажем во второй части нашего блога.

Список использованной литературы

1. Zhou C et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 2019 Jul; 571(7764):275-278.

2. Mojica FJ et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 2019; 155(3):733-740.

3. Nature. News Future. 19 June 2019. CRISPR babies: when will the world be ready?

Актуальное

Главное


Партнеры

Все партнеры