Ограничения НИПТ
В отличие от инвазивных тестов, таких как амниоцентез, которые потенциально могут нанести вред плоду, НИПТ, используемый сегодня, имеют множество преимуществ, включая отсутствие риска для плода, но он также имеет и свои ограничения. Один из главных недостатков заключается в том, что НИПТ иногда дает не точные данные, поскольку при его проведении исследуют фрагменты ДНК, высвобожденные из разрушенных плодовых или плацентарных клеток. Поэтому эти фрагменты ДНК называются внеклеточной ДНК или cfDNA, а не геномной. Соответственно, не всегда исследователи могут достоверно определить, точно ли это ДНК плода. Именно поэтому НИПТ является скринингом, а не окончательным диагностическим тестом.
Таким образом, ученые всегда находятся в поиске лучших НИПТ, которые позволят более точно выявить генетические аномалии плода. Большинство этих методов определяют cfDNA плода, циркулирующую в крови матери с долей больше 4 %. Плодовые клетки в крови матери чрезвычайно редки из-за высокой эффективности плацентарного барьера, и это представляет огромную проблему для ученых. Для повышения вероятности обнаружения ДНК плода во многих тестах используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Это метод, с помощью которого ДНК копируется милионы раз, разработанный американским биохимиком Кэри Муллисом (Kary Mullis), за что он был удостоен Нобелевской премии.
Новый метод
В новом исследовании использовалась модифицированная форма цифровой капельной ПЦР (sc-ddPCR) единичных клеток. Несколько подкорректировав базовую методику, ученые получили подтверждение концепции, согласно которой можно оценивать геном эмбриональных клеток, обнаруженных в чрезвычайно низких концентрациях в материнском кровотоке, из образца крови, взятого из периферической вены. Это открытие позволит разработать тест для оценки ДНК одной живой клетки непосредственно из материнской крови, избегая этапов фиксации клеток, окрашивания клеток и амплификации всего генома.
Исследователь Кеничиро Хата (Kenichiro Hata) поясняет: «Мы наблюдали, что в некоторых случаях результаты НИПТ не согласуются с полученной генетической информацией. Результаты исследования служат доказательством эффективности неинвазивной пренатальной диагностики с использованием циркулирующих плодовых клеток без строгой клеточной очистки».
Модификация
С помощью sc-ddPCR каждая капля находится в ячейке и содержит до 3000 клеток, которые анализируются одновременно. Оригинальный метод дает очень специфичные и чувствительные результаты от одной клетки. Проблема в том, что если клеточная суспензия не имеет четкого фона, она не работает хорошо. Для этого клеточные линии должны быть промыты или должна быть проведена флуоресцентно-активированная сортировка клеток.
Текущая модификация устраняет эту необходимость, обеспечивая лучшую среду ПЦР внутри капли, позволяя повысить чувствительность и специфичность. Это позволяет оценить генетическую информацию от одной клетки на основе грубо очищенного образца, в составе которого есть ядросодержащие клетки.
Исследователи взяли образцы крови у 13 беременных женщин и сосредоточились на использовании грубо отсортированной клеточной суспензии и методов sc-ddPCR для идентификации геномной ДНК мужского плода из плодовых клеток, циркулирующих в крови матери. Они обнаружили, что достигли высокой чувствительности в определении наличия SRY, или определяющего пол Y-гена, хромосомного локуса, который регулирует начало определения пола у мужчины.
Доказательства
Другими словами, ученые обнаружили, что ген SRY присутствовал только в образцах, полученных от 3/13 женщин, беременных плодами мужского пола. Это свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности модифицированной системы sc-ddPCR.
Последствия
Как только эти результаты будут подтверждены на большом количестве образцов крови беременных женщин в отношении других генов, он может быть распространен на многие другие области применения. Хата отмечает: «В будущем, оптимизируя сортировку клеток и инкапсуляцию, а также создавая более эффективную среду ПЦР в каждой капле, мы сможем использовать эту модифицированную систему sc-ddPCR как прорывной метод анализа, который может быть применен в различных областях исследований и, возможно, в клиническом диагностическом тестировании».
Источник: evogenlab.ru
