Новости об этом улучшенном «первичном редактировании» начали циркулировать среди исследователей CRISPR в этом месяце, когда изобретатели обнародовали его на совещании в лаборатории Колд-Спринг-Харбор (Cold Spring Harbor Laboratory). С тех пор «волнение стало ощутимым», - заметил генный инженер Федор Урнов из Калифорнийского университета в Беркли, который не принимал участия в исследовании. «Невозможно преувеличить значение открытия», - объясняет он, сравнивая создание все более разнообразных технологий редактирования генома с созданием супергероев с различными суперспособностями: «Это может стать весьма полезным Мстителем для сообщества по редактированию генома, особенно при переходе от фундаментальных исследований к клинической практике - к лечению разных заболеваний от серповидноклеточной анемии до муковисцидоза».
Изобретатели метода, названного «prime editing», под руководством Дэвида Лю (David Liu) из Института Массачусетского технологического института и Гарварда и научного сотрудника, доктора Эндрю Анзалоне (Andrew Anzalone), утверждают, что метод способен исправить 89% известных генетических вариаций, вызывающих заболевание из-за однобуквенной опечатки, которая вызывает серповидноклеточную анемию, или четырех букв, являющихся причиной болезни Тея-Сакса.
«Существует более 75 000 изменений ДНК, связанных с генетическими заболеваниями», - сообщил Лю репортерам в преддверии публикации в журнале Nature с описанием метода.
Prime editing улучшает CRISPR-Cas9 (и все изменения, которые исследователи внесли в него за последние семь лет) несколькими важными способами, уточнил Лю. Оно может заменить любой из четырех нуклеотидов ДНК или «букв», обозначаемых A, T, C и G, на любой другой, всего 12 возможностей. Одно из ранних изобретений Лю, называемое базовым редактированием, могло выполнять только четыре из этих превращений: C-в-T, T-в-C, A-в-G и G-в-A. Оно не может исправить мутацию, например, в гене гемоглобина, вызывающую серповидноклеточную анемию, потому что она требует точечной замены Т на А.
«Prime editing, - сказал Урнов, - отлично подходит для исправления точечных мутаций», которые являются причиной около 7000 наследственных заболеваний.
В отличие от других форм CRISPR, prime editing легко работает в неделящихся клетках, таких как нейроны и мышечные клетки, которые исследователи, занимающиеся редактированием генома, рассматривают как мишени для лечения заболеваний, начиная от мышечной дистрофии Дюшенна и заканчивая синдромом Ретта.
В дополнение к замене одного нуклеотида на другой, первичное редактирование может удалить определенное количество нуклеотидов точно в нужном месте генома. Например, ученые удалили (из клеток человека, растущих в лабораторных чашках) четыре нуклеотида в гене HEXA, которые вызывают болезнь Тея-Сакса. В другом месте они смогли удалить целых 80.
«Похоже, что prime editing предложит некоторые новые возможности сообществу по редактированию генома», - поделился мнением биохимик Бенджамин Кляйнстивер (Benjamin Kleinstiver) из Массачусетской больницы, чьи исследования направлены на превращение редактирования генома в «молекулярную медицину».
Для других ученых наиболее впечатляющим является способность prime editing вставлять недостающие нуклеотиды или заменять ряд вызывающих заболевание нуклеотидов. Лю и его коллеги добавили 44, но теперь он считает, что «вероятно, будут возможны более крупные вставки и удаления [более 80]».
В классическом CRISPR редактирование генома начинается, когда фермент Cas9 разрезает ДНК в месте, к которому его ведет целевая молекула, называемая направляющей РНК. Это запускает естественный механизм восстановления ДНК, который может реагировать несколькими способами: исправлять разрыв, соединяя два свободных конца вместе; заполнять промежуток нуклеотидами, случайно взятыми из клетки; или исправлять разрыв с помощью фрагмента «отремонтированной» ДНК, предоставленной учеными. Оказывается, клетки гораздо чаще предпочитают первый и второй варианты. Это сделало третий, называемый гомологичным восстановлением, очень трудным вариантом – и это является реальной проблемой, поскольку лечение многих генетических заболеваний потребовало бы такого рода исправлений.
Поэтому способность prime editing заставить человеческие геномы работать по нужному шаблону была особенно важной для других ученых, поскольку «никто ранее не находил хорошего способа сделать это», сказал Урнов. Например, в исследовании, которое потрясло мир в 2017 году ученые сообщили, что человеческие эмбрионы с геном, вызывающим гипертрофическую кардиомиопатию, отклонили здоровый ген, который был введен через CRISPR. Таким образом? использование CRISPR для лечения кардиомиопатии и некоторых других наследственных генетических заболеваний, вероятно, потребует гомологичного восстановления.
Первичное редактирование «работает для целого ряда нуклеотидных изменений, которые могут быть мишенью для коррекции при заболеваниях», - сказала Мария Ясин (Maria Jasin), эксперт по восстановлению ДНК. «Это значимый прогресс».
Молекулы, которые выполняют первичное редактирование, состоят из трех частей. Направляющая РНК, которую команда Лю называет pegRNA (где «pe» обозначает первичное редактирование – prime editing), движется по кратчайшему пути для предварительно запрограммированного места в геноме. PegРНК также содержит нуклеотиды, которые заменяют вызывающие заболевание нуклеотиды в ДНК-мишени. Второй компонент, хромированный фермент Cas9, разрезает одну, а не две цепи ДНК. Третий компонент, фермент, называемый обратной транскриптазой, слитый с Cas9, копирует нуклеотиды РНК, переносимые pegРНК, и превращает их в нуклеотиды ДНК, которые заменяют те, которые находятся в целевом месте.
«Конечным результатом является постоянное редактирование, которое было скопировано из информации, закодированной в pegРНК», - подытожил Лю. Что касается универсальности, он и его коллеги использовали первичное редактирование, чтобы точно удалить два нуклеотида ДНК и, в то же время, преобразовать G в T, «все в одном редактировании».
В настоящее время команда Лю провела тестирование своего изобретения на клетках человека и нейронах мыши. В обоих случаях частота, с которой редактировались нецелевые участки в геноме, была чрезвычайно низкой: частота таких нецелевых изменений была ниже 10%. Эффективность была высокой, обычно от 20% до 50%, в зависимости от вида редактирования, и достигала даже 78%. Другие системы CRISPR изо всех сил пытаются попасть хотя бы в двузначные числа. И только от 1% до 10% первично отредактированных клеток имели нежелательные вставки или делеции нуклеотидов, по сравнению с более чем 90% для некоторых более старых систем CRISPR. Поскольку нежелательные изменения могут вызвать рак или другой геномный хаос, «их избегание при применении генной терапии, безусловно, имеет большое значение», - подчеркнула Ясин.
Один из поводов для беспокойства, которые она и другие сторонние ученые выразили, заключается в том, что клетки человека, используемые для тестирования первичного редактирования, происходят от рака. Хотя эта клеточная линия использовалась в течение многих десятилетий для многих экспериментов, не связанных с раком, она не может быть репрезентативной для того, насколько хорошо этот метод будет действовать в других клетках человека. «Необходимо проделать большую работу в других типах клеток», - отметила Ясин.
Источник перевода: statnews.com
