Оптогенетический инструмент управления экспрессией белков in vivo применили для терапии диабета

Оптогенетический инструмент управления экспрессией белков in vivo применили для терапии диабета

Китайские ученые создали оптогенетический инструмент, который позволяет точно регулировать экспрессию генов, имитируя нормальную экспрессию в живых системах. Представленная ими схема поможет глубже изучить механизмы экспрессии генов в клетках животных. В рамках работы, опубликованной в Nature Communications, исследователи также продемонстрировали потенциальное применение молекулярного инструмента в качестве терапии диабета первого типа.
 124 •
  0
02.02.2021
Ting Li et al. / Nature Communications, 2021

Чтобы понимать, как функционирует тот или иной белок, как клетка отвечает на внешние и внутренние сигналы, необходимо иметь возможность анализировать, как именно экспрессируются гены, и, соответственно, вырабатываются белки. Принято считать, что при постоянных внешних условиях концентрация и функции ключевых регуляторных молекул в клетке не сильно меняются или случайным образом колеблются возле фиксированного значения.

Однако многие регуляторные белки, в том числе и транскрипционные факторы, функционируют «пульсирующим» образом и, соответственно, по-разному влияют на клеточную судьбу, ответ клетки на стрессовые условия и дифференциацию. Ученым удалось объяснить механизмы только некоторых таких пульсирующих механизмов. Создание управляемых пульсирующих систем может быть полезным для дальнейшего изучения их механизма и стоящих за ними биологических функций.

Выделение клетками инсулина относится к такой пульсирующей схеме. Инсулин — белковый гормон, который выделяют бета-клетки поджелудочной железы. Инсулин блокирует выделение глюкозы печенью и способствует тому, чтобы клетки использовали глюкозу, поступающую в кровь из пищи.

В исследовательских работах для управления экспрессией генов широко используются влияющие на нее химические вещества. Однако такие химические индукторы долго не распадаются и потому слишком долго влияют на экспрессию. И если в эксперименте на клеточных культурах можно физически убрать воздействующее вещество (поменять среду), то в экспериментах на животных такой возможности нет (нельзя обратно «отобрать» вещество из клеток животного), и практически невозможно динамично регулировать экспрессию, просто добавляя или убирая химическое вещество. Существуют альтернативные системы, в которых экспрессия генов зависит от света, но применение и таких систем сильно ограничено: сложно «доставить» необходимое количество света глубоко в ткани, потому что ткани сами по себе довольно сильно поглощают свет.

Проблема управления белками интересует не только тех, кто занимается экспрессией генов. Ранее нейробиологии разработали химерные белки, которые одновременно обладают и люминесценцией (способностью светиться), и чувствительностью к свету. Такая особенность позволяла им в присутствии субстрата «запускать» самих себя. Эти белки регулировали работу ионных каналов. В отличие от традиционных химических индукторов, субстрат люциферазы — белка, который издает свечение — легко и быстро используется люциферазой, а поэтому ответ белка быстро достигает своего пика и также быстро исчезает, что делает его динамичным.

Группа ученых из Восточно-китайского университета науки и технологий под руководством И Янa (Yi Yang) предложила использовать подобную систему, в которой сочетается химическая и световая регуляция, для управления экспрессией генов в клетках. Ученые решили создать химерный белок, состоящий из включаемого светом транскрипционного фактора и люциферазы. Для этого они соединили модифицированную люциферазу глубоководной креветки NanoLuc и LOV-домен (light-oxygen-voltage), чувствительный к свету белок растений и грибов, в одну молекулу. При этом LOV-домен хорошо поглощает синий свет (длина волны λ = 440–480 нанометров), а люцифераза NLuc как раз вырабатывает синий свет. Воздействовать на такую систему можно двумя способами: непосредственно светом или предоставляя люциферазе ее субстрат фуримазин. Эксперименты показали, что система действительно функционирует как логический элемент «ИЛИ». Экспрессия контролируемого химерным транскрипционным фактором белка возрастала в 116 раз при добавлении фуримазина с концентрацией 2,5 микромоль, и уменьшалась при дальнейшей увеличении концентрации субстрата.

Рост уровня экспресси белка в зависимости от воздействия на химерный транскрипционным фактор светом и фуримазином

Ting Li et al. / Nature Communications, 2021

По замыслу ученых, люцифераза в транскрипционном факторе быстро использует предоставленный ей субстрат, и как только он заканчивается, транскрипционным фактор перестает активировать транскрипцию гена. Для того чтобы проверить, насколько созданный ими фактор отвечает ожиданиям, исследователи измерили уровень экспрессии контролируемого им белка в зависимости от времени. Согласно результатам измерений, через 4-6 часов после добавления фуримазина уровень синтеза белка достигал максимума, а затем резко снижался.

Далее исследователи протестировали систему in vivo на животных моделях. Печень мышей трансфицировали плазмидами, в которых экспрессия репортерного флуоресцентного белка контролировалась разрабатываемым химерным транскрипционным фактором. После введения мышам фуримазина, экспрессия репортерного белка также достигала максимум через четыре часа и резко снижалась после. При этом амплитуда уровня экспрессии менялась с концентрацией вводимого фуримазина. Кроме того, экспрессию белка можно было повторно «включать» с интервалами в восемь часов.

В заключение группа ученых показала разработанную ими схему как потенциальный способ терапии диабета. Клетки, в которых выработка инсулина контролировалась химерным транскрипционным фактором, инкапсулировали в полупроницаемую мембрану. Пропускающая только низкомолекулярные соединения (< 72 килодальтон) мембрана защищает чужеродные клетки от физического контакта с иммунной системой животного-хозяина. Мышам с диабетом первого типа выдавали по пять миллиграмм фуримазина на киллограмм массы животного и измеряли содержание глюкозы в крови спустя три часа. Уровень глюкозы у мышей с имплантированными клетками снизился по сравнению с остальными (мышами без импланта, не получившими фуримазин мышами).

Ученые отмечают, что эффект от перорального приема фуримазина был сопоставим с внутривенным и внутрибрюшинным введением вещества. Пероральный способ — наиболее предпочтительный, потому что не вызывает боль и тревожность у животных и людей. К тому же, на данный момент не существует пероральной терапии диабета первого типа — пациенты вынуждены делать внутримышечные инъекции инсулина, чтобы контролировать содержание глюкозы в крови после приемов пищи.

Также исследователи заметили, что оптимальная доза фуримазина, достаточная для поддержания необходимого уровня глюкозы в крови, была разной в зависимости от интервалов времени между приемами пищи. Возможно, это позволит создать клеточную терапию, дозировку которой можно будет корректировать в зависимости от пищевых привычек пациентов.

Источник: nplus1.ru

Комментарии для сайта Cackle

Актуальное

Главное


Партнеры

Все партнеры