В данной статье мы сообщаем о разработке нового подхода и ранних результатах клинического применения неинвазивного пренатального секвенирования панелей генов для частых доминантных моногенных заболеваний. Внеклеточная ДНК (вкДНК), выделенная из материнской плазмы, была штрих-кодирована, обогащена, а затем проанализирована с помощью секвенирования нового поколения (NGS) для целевых регионов. Патогенные или вероятно патогенные мутации были подтверждены вторичным секвенированием ампликонов вкДНК. Клинические испытания были выполнены на 422 беременностях, среди которых была группа с патологическими результатами УЗИ или отягощенной наследственностью и контрольная здоровая группа. Последующие исследования случаев подтвердили 20 истинно положительных, 127 истинно отрицательных, ноль ложноположительных и ноль ложноотрицательныхрезультатов. Раннее клиническое исследование показало, что данный неинвазивный тест может предоставить ценную молекулярную информацию для обнаружения широкого спектра доминантных моногенных заболеваний, дополняющих текущий скрининг на анеуплоидию и скрининг носителей для рецессивных болезней.
С момента открытия циркулирующей внеклеточной эмбриональной ДНК в конце 1990-х годов был разработан неинвазивный пренатальный скрининг (НИПС) для выявления частых хромосомных анеуплоидий плода с использованием крови беременной женщины. НИПС имеет гораздо более высокую чувствительность и специфичность, чем предудыщуие скрининги сыворотки матерей на трисомиии 21, 18 и 13. НИПС также все чаще используется для скрининга анеуплоидий половых хромосом и микроделеций. Мы отметили, что почти 60% тяжелых моногенных заболеваний являются доминантными расстройствами, причем большинство из них вызваны мутациями de novo, но пренатальный скрининг на такие заболевания не был доступен, несмотря на их относительно высокую распространенность. Важно заметить, что секвенирование нового поколения (NGS) обеспечивает точный и гибкий подход к неинвазивной пренатальной диагностике распространенных доминантных дисплазий скелета. Целенаправленное неинвазивное пренатальное тестирование было разработано для моногенных заболеваний с помощью цифровой ПЦР, секвенирования по Сэнгеру или NGS для небольшого количества вариантов или генов. Эти методы ограничены их фокусом на мутациях в небольших целевых регионах и использованием локус-специфических праймеров, которые предотвращают одновременное обнаружение многих спорадических мутаций в сильно фрагментированной вкДНК.
Мы разработали новый подход НИПС для обнаружения мутаций de novo или наследственных родительских вариантов у 30 генов с частыми доминантными моногенными болезнями человека, которые могут привести к значительным неблагоприятным последствиям для здоровья с суммарной частотой встречаемости примерно 1 на 600 (таблица 1). Во время создания библиотеки и процесса секвенирования для анализа NGS, в низкоуровневые последовательности могут быть внесены изменения, которые приводят к артефактам. Чтобы их уменьшить, мы использовали уникальный молекулярный метод индексации (UMI или молекулярное штрихкодирование) для NGS анализа (рис. 1а,b). После целевого обогащения на основе гибридизации, была достигнута адекватная последовательность так, что у большинства UMI-маркированных молекул ДНК было по крайней мере по два читаемых дубликата (рис. 1c). Ошибки, внесенные при подготовке библиотеки NGS и процесса секвенирования, были значительно сокращены методом UMI для вариантов с фракцией ≤ 2,5% (P <0,05, Рис. 1d). Затем мы разработали метод расчета фетальной фракции (ФФ) на основе однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), изучая родительские аллели в эмбриональной вкДНК, присутствующей в материнской плазме.
Мы сравнили производительность расчета ФФ на основе SNP с результатами, полученными методом Y-хромосомы, на 31 образце от беременностей с мужскими зародышами (R = 0,981, доп. рис. 1a) и исследования spike-in смешанной ДНК пробанда-матери с фракциями ДНК пробанда в диапазоне от 1,0 до 20,0% (R = 0,980, доп. рис. 1b). Кроме того, мы сравнили рассчитанную ФФ для 67 образцов вкДНК, взятых у беременных женщин (ФФ в пределах 5,0–27,6%) с результатами, проанализированными независимым методом, который дал схожие результаты (R = 0,972, доп. рис. 1c). Для того чтобы оценить чувствительность, мы исследовали 30 генов, включенных в панели секвенирования в 76 проверочных образцах. Те варианты, которые, по-видимому, оказались de novo, и были выявлены в первичном анализе, подвергались вторичному целевому анализу с использованием вкДНК. Дополнительное преимущество использования вторичного анализа заключается в том, что он одновременно выполняется для материнских лейкоцитов и плазмы вкДНК, что позволяет выявить даже низкий уровень материнского мозаицизма, который является потенциальной причиной ложноположительных результатов у плода в первичном анализе. Ложноотрицательные результаты были определены как мутации (унаследованные или варианты de novo), которые должны были присутствовать, но не были обнаружены в вкДНК. Не было выявлено ложноположительных или ложноотрицательных результатов в 76 образцах, использованных для проверки достоверности.
Всего было получено 458 клинических образцов из 131 клиники в США, Европе и Азии. Из этих образцов 422 соответствовали критериям включения. Средний срок беременности на момент сбора составлял 16,8 недели (в диапазоне 9,0–38,3 недель, рис. 2). Возраст родителей варьировал: 241 (57,1%) женщина старшей возрастной группы (≥ 35 лет) и 201 мужчина (47,6%) старшей возрастной группы (≥ 40 лет). Из 422 женщин всего 151 (35,8%) сообщили о патологических данных пренатального УЗИ, указывающих на аномалию развития плода, 3 (0,7%) имели патологические результаты скрининга сыворотки, и 43 (10,2%) сообщили об отягощенном семейном анамнезе по генетическим заболеваниям. Из 151 случая с ненормальным пренатальным УЗИ 28 дали положительный результат по наличию патогенной или вероятно патогенной мутации de novo в одном из 30 генов панели скрининга (Таблица 1). В этих положительных случаях средний возраст матери и отца составлял 31,7 и 35,6 года соответственно. Чаще всего положительный результат молекулярного исследования встречался у плодов с нарушением развития скелета (19 из 59 случаев, 32,2%), которые включали аномалии конечностей, пальцев, черепа и туловища. Другие фенотипические категории с положительными молекулярными результатами включали нарушения носовой кости или кистозную гигрому (2 из 24 случаев, 8,3%), пороки сердца (2 из 11 случаев, 18,2%), черепно-лицевые аномалии (2 из 8 случаев, 25,0%) и мультисистемные аномалии (3 из 12 случаев, 25,0%). Примечательно, что варианты de novo, выявленные в этих 28 случаях, соответствовали заболеваниям, связанным с фенотипом плода, наблюдаемым на пренатальных УЗИ (Таблица 1). Например, патогенные мутации de novo в генах COL1A1 или COL1A2 были обнаружены у субъектов P1 – P8, которые все имели плод с нарушениями скелета, включая короткие, изогнутые или сломанные кости. У субъектов P9 – P18 выявлены патогенные варианты de novo в гене FGFR3, связанном с ахондроплазией и танатофорной дисплазией, что согласуется с УЗИ плода, демонстрирующими короткую бедренную кость, выпуклый лоб или маленькие окружности груди и брюшной полости. У P19 и P20 - патогенные варианты de novo были обнаружены в гене FGFR2, связанном с краниосиностозом, что согласуется с неправильной формой черепа плода на УЗИ. У P22 - патогенный вариант de novo, c.1435C> T (p.R479 *) в гене NIPBL, связанном с синдромом Корнелии де Ланге. Этот результат соответствовал результатам пренатального и посмертного обследования: симметричное отставание роста, пороки почек. У P27 и P28 идентифицированы две мутации сайта сплайсинга в гене TSC2, связанном с туберозным склерозом, который часто сочетается с рабдомиомой сердца, которая была обнаружена у этих двух плодов.
Также были проанализированы примерно 26 случаев с отягощенным семейным анамнезом. У P29 был обнаружен патогенный вариант c.3076C> T (p.R1026 *) в гене COL1A1, связанном с несовершенным остеогенезом I типа, хотя на УЗИ не выявили грубых структурных аномалий (Таблица 1). Эта мутация также присутствовала у отца, у которого ранее был диагностирован несовершенный остеогенез тип I. У субъектов P30 – P32 патогенные родительские варианты были выявлены в вкДНК материнской плазмы до 13 недели гестационного возраста, в то время как в других пяти случаях (P33 – P37), в которых отцы имели клинический диагноз генетического заболевания, в вкДНК не было выявлено родительских мутаций. В 27 случаях, где предыдущая беременность или родные братья или сестры имели патогенную мутацию de novo, не было найдено патогенных вариантов при текущей беременности.
Информация о результатах 76 проверок (3 положительных и 73 отрицательных случая) и 422 клинических случая (32 положительных и 390 отрицательных случаи) была изучена с помощью вопросника. Исследуемые ответили на опрос по 233 случаям из 498 (46,7%, рис. 3). Были получены данные об исходе беременности: 26 из 35 (74,2%) положительных случаев, 1 из 35 (2,9%) самопроизвольный аборт, 8 из 35 (22,9%) искусственное прерывание беременности, 7 из 35 (20%) смерть новорожденных и 10 из 35 (28,6%) родов с выживаемостью новорожденных (рис. 3). Результаты от инвазивного или постнатального секвенирования были доступны для 18 из 35 (51,4%) положительных случаев, среди которых 10 из 35 (28,6%) выбрали инвазивное тестирование, а 8 из 35 (22,9%) прошли постнатальное тестирование. Кроме того, 2 случая из 35 (5,7%) были подтверждены послеродовым клиническим обследованием без дальнейшего тестирования (рис. 3). В общей сложности, были подтверждены имеющейся диагностической информацией положительные результаты всех 20 из 20 (100%) случаев. Из других положительных 9 из 35 (25,7%) пациентов отказались от диагностического тестирования, а результаты диагностики 6 из 35 (17,1%) положительных случаев отсутствовала. С исследуемыми связались и призвали давать информацию о любых ложноотрицательных результатах, но о таких случаях не сообщалось. Исследуемые ответили на запрос по 198 случаю из 463 (42,7%) отрицательных случаев (Рис. 3). Мы определили, что 127 отрицательных случаев по скринингу дали отрицательный результат и на основе диагностического генетического тестирования или послеродового клинического обследования. Тем не менее, потенциальные ложноотрицательные результаты не могут быть полностью исключены из-за возможного позднего начала или стертого фенотипа. В целом, в случаях, когда мы смогли получить точные данные клинического исхода, мы подтвердили 20 истинно положительных, 127 истинно отрицательных, ноль ложноположительных и ноль ложноотрицательных результатов в последующем клиническом исследовании (рис. 3).
Технические достижения, которые мы сделали в этой работе для неинвазивного пренатального секвенирования часто встречающихся заболеваний человека, включают в себя молекулярную индексацию вкДНК для точного подсчета молекул ДНК и низкого уровня вариантов плода; целевое обогащение гибридизацией вместо амплификации ПЦР, для устранения потерь аллелей в сильно фрагментированной вкДНК; секвенирование всего гена для обнаружения всех мутаций в генах-мишенях; комплексный анализ фетальной фракции на основе SNP. Представленный метод анализа и аналитические алгоритмы могут быть использованы для расширения текущего теста, чтобы включить в него еще большее количество доминантных заболеваний.
Некоторые моногенные заболевания с относительно высокой встречаемостью часто подозреваются, когда внутриутробно плод имеет аномальные сердечные, скелетные, или другие структурные ультразвуковые изменения. Например, группа синдромов Нунан представляет собой несколько аутосомно-доминантных заболеваний, которые могут иметь пренатальные ультразвуковые признаки, схожие с трисомией 21, 18 и 13. Связанные с FGFR3 скелетные нарушения являются еще одной группой заболеваний, которые часто подозреваются по УЗИ при укорочении бедра и плеч и/или выступающих лобных буграх во втором триместре. Для таких беременностей с подозрительными пренатальными данными УЗИ часто необходимо молекулярно-генетическое тестирование после инвазивной диагностической процедуры. Однако, когда конкретный диагноз не указан, и присутствуют только «мягкие маркеры» (например, полупрозрачность или укорочение длинных костей), пациенты часто не хотят проходить инвазивную процедуру и предпочитают неинвазивную диагностику.
Молекулярные причины доминантных заболеваний, таких как синдромы Нунан и FGFR3-связанные скелетные аномалии, включают варианты de novo, которые встречаются чаще при более старшем возрасте родителей. В 28 положительных клинических случаях, в которых мы выявили патогенные или вероятные патогенные варианты de novo, средний родительский возраст составлял ~ 36 лет. Современные рекомендации по консультированию родителей старшей возрастной группы используют цифру в 40 лет, что на четыре года старше, чем средний возраст родителей больных плодов с мутациями de novo в этом исследовании. Таким образом, дальнейшие систематические исследования могут быть оправданы для установления более точного продления цифры возраста для генетического консультирования и потенциального скрининг групп высокого риска. В качестве альтернативы, такие исследования могут уточнить, должен ли скрининг предлагаться более широко, независимо от возраста родителей.
В целом, подход НИПС, представленный в данной статье, обеспечивает ценную молекулярную информацию о рисках плода, связанных с частыми доминантными моногенными болезнями человека и помогает принимать решения врачам и родителям для дальнейшего управления беременностью.
Перевод студента 6 курса ФГБОУ ВО ПИМУ Дениса Черневского
Источник: nature.com
Приложение. Табл. 1
