- Технологии редактирования генома на основе CRISPR-Cas систем в современном мире развиваются очень стремительно. Популярны системы редактирования, основанные на комбинации белка Cas9 и короткой направляющей (гидовой) РНК. Данный комплекс соединяется с геномной ДНК в том месте, где последовательность нуклеотидов совпадает с последовательностью гидовой РНК. Таким образом, синтезируя различные варианты последовательностей гидовой РНК, можно направлять Cas9 к тому участку ДНК, который нужно отредактировать. Дальше возможны варианты, например, когда Cas9 раскусывает обе нити ДНК в нужном месте, после чего системы репарации пытаются залатать двуцепочечный разрыв, используя гомологичный фрагмент ДНК в качестве матрицы для восстановления поврежденного участка, либо можно ввести в клетку искусственную матрицу, для того чтобы добиться нужных изменений в репарируемой последовательности, - поясняет Сергей Попов.
Эксперт также обращает внимание на побочные эффекты, возникающие в процессе работы с этими инструментами. Один из них - так называемый эффект «оффтаргетинга» - большое количество ошибок, которые возникают в процессе «залечивания» двуцепочечных разрывов.
- В настоящее время разработаны и активно внедряются более «щадящие» способы редактирования генома, не связанные с внесением двойных разрывов в ДНК. Один из таких способов был предложен группой ученых из Гарвардского университета, разработавших мутантную форму белка Cas9 c никазной активностью (когда разрезается только одна цепь ДНК). К этому мутантному белку пришивается фермент цитидиндеаминаза. Этот фермент заменяет цитозин на урацил. Но, урацила в норме в ДНК не должно быть и ферменты репарации внимательно следят за этим. «Бракованный» фрагмент вырезается и за счет спонтанного дезаминирования цитозина, в результате чего возникает часто встречаемая мутация С-Т, которая плохо поддается репарации. Поэтому, чтобы система редактирования оснований работала в нужном направлении, добавляются специальные ингибиторы фермента, вырезающего урацилы. Таким образом, благодаря природным ферментам, которые есть у человека можно аккуратно менять в геноме комплементарные пары С-G на Т-А.
А что касается обратной замены Т-А на C-G, то у человека нет природных редактирующих ферментов, которые бы дезаминировали аденин в ДНК. Между тем, такая замена необходима для исправления около 48% известных человеческих патогенных олигонуклеотидных вариантов. Поэтому безопасный и надежный молекулярный редактор, превращающий Т-А в C-G стал давней мечтой молекулярных генетиков. Чтобы приблизить ее, из бактерии E.coli выделили фермент аденозиндеаминазу (TadA) и многократно мутировали, подвергнув его искусственной эволюции. TadA способен отрезать аминогруппу от азотистого основания аденина. К нему через гибкий фрагмент длиной в пару десятков аминокислотных остатков пришили конструкцию Cas9, лишенную каталитической функции. Такая версия Cas9 распознает только место своей посадки и не способна вносить никакие разрывы. Задумка была в том, что такая «мертвая» Cas9 наводится на место редактирования гидовой РНК, притаскивая с собой аденозиндеаминазу. Дезаминаза отщепляет от аденина пары Т-А аминогруппу, превращая его в иннозин. Иннозин не характерное для ДНК соединение, поэтому распознается системами репарации как гуанин. В результате получается некомплиментарная пара И~Т, которая в ходе следующего раунда репарации меняется на C-G. Данная конструкция получила название АВЕ (adenine base editor), - рассказывает Сергей Попов.
- Аналогичная усовершенствованная конструкция АВЕ 7.10 F148A была применена в недавнем исследовании китайских ученых. Благодаря инжинирингу новых деаминаз она имела более высокую точность и более низкую частоту оффтаргетинга в сравнении с предыдущими версиями. Несомненно, данная генетическая конструкция может быть потенциально использована для лечения редких наследственных заболеваний. Однако, необходимы дальнейшие исследования и доработки, чтобы уменьшить частоту ошибок данной конструкции в клинической практике, - добавляет эксперт.
