Исследование CRISPR показывает, что Cas12a может выбирать последовательности ДНК-мишеней более точно, чем Cas9

Исследование CRISPR показывает, что Cas12a может выбирать последовательности ДНК-мишеней более точно, чем Cas9

Известно, что фермент Cas9 имеет определенные проблемы со связыванием с нецелевыми ДНК-последовательностями, но он по-прежнему считается золотым стандартом фермента CRISPR для редактирования генома.
 99 •
  0
05.09.2018

Однако в новом исследовании в Molecular Cell ученые из Техасского университета в Остине предположили, что фермент Cas12a, ранее известный как Cpf1, является более точным, чем Cas9, и приводит к редактированию генома. Кроме того, он достаточно безопасен для использования на людях.

«Общая цель состоит в том, чтобы найти лучший фермент, который дала нам природа, а затем сделать его еще лучше, вместо того, чтобы взять первый, который был обнаружен исторически случайно», - сказал в заявлении Илья Финкельштейн, доцент молекулярных биологических наук в UT Austin и соавтор исследования.

Исследователи использовали количественные кинетики, чтобы определить, как Acidaminococcus sp Cas12a нацеливается на ДНК. Они обнаружили, что фермент связывается с ДНК плотно в двух кинетически отделимых шагах. Сначала фермент распознает ориентированный на смежный с protospacer мотив (protospacer-adjacent motif (PAM), а затем он распространяет ограничивающую скорость R-петлю, что приводит к неизбежному расщеплению ДНК обеих нитей. Как только эти два этапа завершены, Cas12a функционально необратимо связывается с последовательностью ДНК-мишени.

Однако Cas12a также хорошо различает несовпадения вдоль большей части последовательности ДНК. «Этот результат подразумевает существенную обратимость во время образования R-петли - состояние позднего перехода», - пишут авторы.

«Это делает процесс формирования пар оснований более обратимым», - добавил в своем заявлении старший автор Рик Рассел. Другими словами, Cas12a лучше справляется с проверкой каждой пары оснований перед тем, как перейти к следующей. После семи или восьми пар Cas9 перестает проверять, в то время как Cas12a продолжает проверять до 18 пар».

Команда начала исследование с создания полной кинетической структуры для Cas12a на соответствующей ДНК-мишени. Они измеряли скорости связывания и диссоциации ДНК, а также расщепление каждой цепи ДНК с использованием РНК-загруженной CRISPR Cas12a и олигонуклеотидной ДНК-мишени. В ходе различных экспериментов исследователи заметили, что образование R-петли с помощью Cas12a происходит быстро, а процесс завершался в течение нескольких секунд. Далее они отметили, что расщепление ДНК Cas12a происходило на несколько порядков быстрее, чем диссоциация из согласованной ДНК-мишени, что указывает на то, что по существу каждое полное событие связывания Cas12a приводит к расщеплению ДНК.

Чтобы измерить специфичность Cas12a к несоответствиям между РНК CRISPR и ДНК-мишенью, исследователи ввели одно изменение в паре оснований ДНК в каждом положении по всей R-петле. Они обнаружили, что, когда РНК Cas12a-CRISPR была привязана к своей ДНК-мишени, образование R-петли имело более позднее переходное состояние, и образовалось больше пар оснований.

«Действительно, если предположить, что R-петля начинает формироваться рядом с последовательностью PAM, чувствительность скорости связывания с PAM-дистальными несоответствиями означает, что распространение R-петли остается легко обратимым до тех пор, пока не будет сформирован почти весь цикл», - писали авторы. «Биологически, это позднее переходное состояние, как предполагается, позволяет Cas12a различать несоответствия, несмотря на необратимый характер общего процесса связывания».

Перевод Николая Мосякина, студента Новосибирского государственного медицинского университета

Комментарии для сайта Cackle

Актуальное

Главное


Партнеры

Все партнеры