Однако в новом исследовании в Molecular Cell ученые из Техасского университета в Остине предположили, что фермент Cas12a, ранее известный как Cpf1, является более точным, чем Cas9, и приводит к редактированию генома. Кроме того, он достаточно безопасен для использования на людях.
«Общая цель состоит в том, чтобы найти лучший фермент, который дала нам природа, а затем сделать его еще лучше, вместо того, чтобы взять первый, который был обнаружен исторически случайно», - сказал в заявлении Илья Финкельштейн, доцент молекулярных биологических наук в UT Austin и соавтор исследования.
Исследователи использовали количественные кинетики, чтобы определить, как Acidaminococcus sp Cas12a нацеливается на ДНК. Они обнаружили, что фермент связывается с ДНК плотно в двух кинетически отделимых шагах. Сначала фермент распознает ориентированный на смежный с protospacer мотив (protospacer-adjacent motif (PAM), а затем он распространяет ограничивающую скорость R-петлю, что приводит к неизбежному расщеплению ДНК обеих нитей. Как только эти два этапа завершены, Cas12a функционально необратимо связывается с последовательностью ДНК-мишени.
Однако Cas12a также хорошо различает несовпадения вдоль большей части последовательности ДНК. «Этот результат подразумевает существенную обратимость во время образования R-петли - состояние позднего перехода», - пишут авторы.
«Это делает процесс формирования пар оснований более обратимым», - добавил в своем заявлении старший автор Рик Рассел. Другими словами, Cas12a лучше справляется с проверкой каждой пары оснований перед тем, как перейти к следующей. После семи или восьми пар Cas9 перестает проверять, в то время как Cas12a продолжает проверять до 18 пар».
Команда начала исследование с создания полной кинетической структуры для Cas12a на соответствующей ДНК-мишени. Они измеряли скорости связывания и диссоциации ДНК, а также расщепление каждой цепи ДНК с использованием РНК-загруженной CRISPR Cas12a и олигонуклеотидной ДНК-мишени. В ходе различных экспериментов исследователи заметили, что образование R-петли с помощью Cas12a происходит быстро, а процесс завершался в течение нескольких секунд. Далее они отметили, что расщепление ДНК Cas12a происходило на несколько порядков быстрее, чем диссоциация из согласованной ДНК-мишени, что указывает на то, что по существу каждое полное событие связывания Cas12a приводит к расщеплению ДНК.
Чтобы измерить специфичность Cas12a к несоответствиям между РНК CRISPR и ДНК-мишенью, исследователи ввели одно изменение в паре оснований ДНК в каждом положении по всей R-петле. Они обнаружили, что, когда РНК Cas12a-CRISPR была привязана к своей ДНК-мишени, образование R-петли имело более позднее переходное состояние, и образовалось больше пар оснований.
«Действительно, если предположить, что R-петля начинает формироваться рядом с последовательностью PAM, чувствительность скорости связывания с PAM-дистальными несоответствиями означает, что распространение R-петли остается легко обратимым до тех пор, пока не будет сформирован почти весь цикл», - писали авторы. «Биологически, это позднее переходное состояние, как предполагается, позволяет Cas12a различать несоответствия, несмотря на необратимый характер общего процесса связывания».
Перевод Николая Мосякина, студента Новосибирского государственного медицинского университета
