Расшифровка генома коронавируса
31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения была передана информация о нескольких случаях вирусной пневмонии, вызванной неизвестным патогеном. Уже в начале января китайские службы здравоохранения полностью расшифровали геном нового коронавируса, а 29 января геном вируса был передан ученым из России.
В марте специалистам ФГБУ НИИ гриппа имени Смородинцева при Министерстве здравоохранения удалось расшифровать первый полный геном коронавируса SARS-CoV-2 из России из материала, полученного от одного из заболевших.
«15 марта был мазок, а 19 марта мы выгрузили в базу данных GISAID полный геном этого вируса. Это быстро. Для вирусов гриппа общепринято считать 21 день хорошей скоростью. Сейчас среднее время выполнения генетического анализа SARS-CoV-2 в НИИ гриппа составляет 20 дней. Безусловно, мы стремимся к тому, чтобы получать и публиковать генетические данные максимально оперативно», - рассказывает Андрей Комиссаров, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева.
Сейчас работа по расшифровке генома коронавируса в НИИ гриппа имени Смородинцева поставлена на поток, однако с момента проведения первого анализа технология претерпела некоторые изменения.
«Для расшифровки генома нового коронавируса используются уже известные и зарекомендовавшие себя технологии NGS. Но протоколы пробоподготовки постоянно совершенствуются. Так, использованный нами протокол ARTIC уже претерпел несколько обновлений. Сейчас используется его 3-я версия».
Почему недостаточно расшифровать геном одного образца коронавируса?
На сегодняшней день ученые со всего мира просеквенировали уже более 60 000 геномов коронавируса и обменялись этими данными друг с другом на базе GISAID . Такой огромный объем данных позволил исследователям проследить происхождение вспышек COVID-19 в своих странах и точно определить, когда происходила передача в тех или иных районах. В некоторых странах (например, Новой Зеландии), в которых было зафиксировано не так много случаев заболевания, ученые стремятся просеквенировать все имеющиеся у них образцы.
«В настоящее время нет общепринятого мнения о том, какое количество отсеквенированных геномов является минимально необходимым для понимания генетического разнообразия вирусов на какой-либо территории. Однако известно, что увеличение количества исследованных геномов существенно повышает ценность проводимых на их основе филогенетических, филогеографических и филодинамических исследований. Для стран с большим количеством случаев, таких как Россия, не представляется возможным отсеквенировать все циркулирующие вирусы. Актуальной задачей является получение выборки, репрезентативной по географии распространения, времени, клиническим и прочим параметрам. Россия обладает потенциалом для исследования очень большого количества вирусов SARS-CoV-2, если к этой работе подключить геномные центры, не специализировавшиеся ранее на работе с патогенами. По такому пути пошли многие страны, например, Исландия, находящаяся на 3-м месте в Европе по количеству секвенированных SARS-CoV-2. Коллаборация между вирусологическими лабораториями и центрами секвенирования - одна из важнейших целей Консорциума CoRGI , который создается ФГБУ НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева Минздрава России. Распределение задач позволит центрам секвенирования внести свой вклад в исследование SARS-CoV-2. Таким образом, количество и качество данных из России значительно возрастут».
На конец мая, по данным GISAID, Россия находилась на 10 месте в Европе по количеству секвенированных вирусов SARS-CoV-2.
«Мы опережаем по этому показателю, например, Германию и Италию. Поэтому я бы не стал говорить, что мы просеквенировали мало образцов. При наличии необходимого финансирования количество генетических данных можно довольно быстро увеличить в десятки раз», - поясняет Андрей Комиссаров.
ПЦР-тест на коронавирус: работает ли он?
Благодаря тому что геном коронавируса был расшифрован в довольно короткий срок, стало возможным разработать и диагностические тесты на коронавирус.
Согласно Временным методическим рекомендациям «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» диагноз устанавливается на основании клинического обследования, данных эпидемиологического анамнеза и результатов лабораторных исследований, в том числе методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) – это диагностический метод, который основан на создании большого числа копий (этот процесс называется «амплификация») искомой нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) из исходного образца с его последующим анализом. ПЦР позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. В результате концентрация искомой нуклеиновой кислоты увеличивается, а значит, ее легче обнаружить.
Но достаточно ли надежные результаты дает ПЦР-тестирование? На этот вопрос ответил Александр Бабий, специалист технологической поддержки ООО «ДНК-Технология».
«Безусловно, можно и нужно оценивать ПЦР-диагностику в России как эффективную, так как различий никаких нет в самом принципе метода ПЦР, который применяется у нас и за рубежом. Более того, в России существуют наборы и приборы для ПЦР-исследований, произведенных как в России, так в других странах, что говорит о том, что подход к клиническому методу исследования ПЦР во всех странах одинаков», - утверждает эксперт.
Однако в СМИ и социальных сетях можно найти сообщения о том, что в реальности по итогам ПЦР-тестирования диагноз зачастую либо ставится ложно, либо наоборот – не ставится, хотя фактически человек болен.
«Есть очень много причин, по которым результат может быть ложным. Например, взятие мазка из зева необходимо осуществлять натощак или через 3 часа после приема пищи, запрещается чистить зубы, полоскать ротовую полость и пить – немногие пациенты об этом знают, что приводит к ложноотрицательным результатам.
Еще одна причина: для получения большей концентрации вируса необходимо брать мазок в одну пробирку и из носоглотки, и из ротоглотки, в противном случае, при взятии только одного мазка, можно получить ложноотрицательные результаты.
На получение недостоверных результатов может повлиять обращение с материалом (неправильная транспортная среда, в которую берут мазок, неправильный температурный режим и время хранения, неправильная транспортировка).
На получение ложноотрицательных результатов влияет отсутствие бракеража пробирок при приеме их в лабораторию. Если пробирки не упаковали в отдельные герметичные пакеты с адсорбирующим материалом, то при транспортировке возможно раскупоривание пробирки, и если в этой пробирке положительный образец, то в результате можно получить ложноположительные результаты во всей партии образцов. Более того, так можно законтаминировать мебель и оборудование в лаборатории и еще некоторое время получать ложноположительные результаты.
Еще ложноотрицательные результаты можно получить при неправильном выборе набора реагентов для выделения», - рассказывает Александр Бабий.
Кроме того, поясняет эксперт, на рынке зарегистрированных тест-систем очень большой разброс чувствительности. Это значит, что по результатам тестирования в одной лаборатории человек может получить положительный результат, тогда как в другой лаборатории результат окажется отрицательным. Особенно, если пациент заразился не так давно. В то же время, если тест-система официально зарегистрирована, предполагается, что ей можно доверять.
«Все наборы с разной чувствительностью имеют место быть, и их результатам можно полностью доверять, если выполнять все манипуляции согласно инструкции к наборам реагентов. Главное: при отправке образцов в референтные лаборатории указывать название производителя наборов реагентов, на которых были получены положительные результаты».
Может ли генетика предсказать вероятность заражения коронавирусной инфекцией и тяжесть течения заболевания?
Помимо ПЦР-тестирования есть и другие методы анализа на коронавирусную инфекцию. В частности, тест на наличие антител к коронавирусу, который может показать, сталкивался ли человек с инфекцией, даже если симптомов COVID-19 у него не было. Когда эти тесты стали проводиться массово, выяснилось, например, что по ряду регионов России число пациентов с бессимптомным коронавирусом достигает 50 %. Но почему одно и то же заболевание у одних людей протекает бессимптомно, а у других с тяжелыми осложнениями вплоть до летального исхода? Не вызывает сомнений, что здесь играют роль множество различных факторов. И один из них – генетические особенности человека.
Уже сегодня есть предварительные исследования, которые демонстрируют, что симптомы COVID-19 могут определяться генетикой. Однако, как отмечает врач-клинический фармаколог лаборатории EVOGEN Ксения Федулова, несмотря на то, что регулярно появляются сообщения о выявлении генетических маркеров, которые могут повлиять на течение коронавирусной инфекции, до сих пор ни один из них не включен в клинические рекомендации по лечению данного заболевания.
«Я бы выделила несколько интересных исследований, но нужно понимать, что все они предварительные и требуют проверки. Например, согласно данным китайских ученых, обладатели группы крови A имеют более высокий риск заражения. Они изучили информацию о 2173 пациентах, госпитализированных с коронавирусной инфекцией. Из 2173 пациентов 37% имели группу A, из 206 погибших пациентов группу крови А имели 41%», - рассказывает эксперт.
Еще один фактор, который предположительно может влиять на тяжесть течения коронавирусной инфекции: система гистосовместимости HLA, которая кодирует специфические белки на поверхности иммунных клеток. Эти белки участвуют в связывании чужеродных белков, в том числе вирусных.
«Согласно исследованиям определенный вариант мутаций в системе HLA приводит к повышению предрасположенности к вирусным инфекциям, в том числе к коронавирусной инфекции . Еще в одной работе была установлена взаимосвязь между гаплотипом системы HLA и тяжестью течения», - поясняет Ксения Федулова.
Однако, как отмечает эксперт, все эти знания пока не могут быть внедрены в клиническую практику.
«Это связано с требованиями к доказательной базе: результаты доклинических исследований на клеточной культуре нуждаются в дальнейшем подтверждении на животных моделях, и только затем возможно проведение клинических исследований. Кроме того, необходимы данные рандомизированных клинических исследований – то есть должны быть группы контроля, случайное распределение пациентов. Для персонализированной терапии инфекций, необходима не только информация о генетических особенностях пациента, но и данные метагенома, то есть информация о генетических особенностях инфекционного агента. И для коронавируса уже выделены генетические особенности, которые могут определить более тяжелое течение».
Что показала пандемия COVID-19?
Пандемия COVID-19 еще продолжается, но уже можно оценить, были ли мы к ней готовы, и спрогнозировать, к каким последствиям для генетики она может привести.
«Эпидемия показала, что Россия обладает необходимыми технологиями и квалифицированными специалистами для генетического анализа SARS-CoV-2. Так, благодаря опыту, который был накоплен в сфере надзора за гриппом, и опыту международных коллабораций, для нас, например, не составило большого труда внедрить в практику разработанный Ником Ломаном и Джошем Квиком протокол секвенирования SARS-CoV-2. В настоящее время уже 6 учреждений в России публикуют генетические данные SARS-CoV-2 в международной базе данных EpiCov GISAID», - рассказывает Андрей Комиссаров.
Однако эксперт указывает и на проблемы, которые обнаружила пандемия в сфере лабораторной диагностики и генетики в России.
«В российских реалиях необходимо устранить бюрократические проблемы с доступом к образцам и их логистике. Важно также привлекать инвестиции для поиска и идентификации новых вирусов (virus discovery) методами секвенирования нового поколения. На примере текущей пандемии можно видеть, какой разрушительный потенциал могут иметь ОРВИ и пневмонии неустановленной этиологии, которой весь декабрь 2019 года считалось заболевание, впоследствии названное COVID-19. Между тем, в российской медицинской практике возбудителей ОРВИ, пневмоний и ОКИ идентифицируют лишь в очень небольшом количестве случаев. Усиление молекулярно-генетического надзора за циркулирующими вирусами и налаживание системной работы по идентификации вновь возникающих патогенов очень важны для контроля над инфекционными заболеваниями, который, как мы можем видеть в случае с COVID-19, не был полностью реализован».
Среди наиболее острых проблем, которые выявила пандемия, Ксения Федулова выделяет достоверность данных, полученных в небольших клинических исследованиях, скорость внедрения новых рекомендаций в клиническую практику и возможность беспрепятственного взаимодействия ученых и врачей из разных стран.
По ее мнению, последствия пандемии приведут к более активному исследованию метагенома.
«Я думаю, что исследования метагенома будут проводиться более активно, то есть мы будем уделять больше внимания изучению генетических особенностей и вирусов, и бактерий. Более пристально будут изучаться новые мутации, которые могут повысить вирулентность микроорганизмов. Уже получены новые данные о генах, которые влияют на восприимчивость к инфекционным болезням. Думаю, что эти исследования продолжатся, и мы сможем использовать эти данные в клинической практике. Однозначно больше внимания будут уделять исследованиям, проведенным in silico, то есть при помощи компьютерных технологий – молекулярного докинга, нейросетей. Эти исследования проводятся биоинформатиками, они позволяют производить анализ огромных массивов данных и предсказывать с большой долей вероятности лекарственную активность химических молекул», - поясняет Ксения Федулова.
