В феврале 2018 года появилась надежда на ускоренное распространение исследований этой системы и в России: президент Владимир Путин поставил задачу в кратчайшие сроки разработать программу геномных исследований, прослушав доклад о «природоподобной» технологии изменения генома CRISPR на Совете по науке и образованию.
О том, почему CRISPR-системы вызывают споры не только среди широкой аудитории, но и внутри научного сообщества, есть ли будущее у этого способа редактирования генома в России и как скоро CRISPR-технологии станут повседневной реальностью, рассказал молекулярный генетик, заведующий отделом неинвазивной пренатальной диагностики «MedicalGenomics», PhD Сергей Попов в интервью нашему порталу.
- Сергей Владимирович, сегодня существует несколько различных способов редактирования генома, в том числе, ZFNs, TALENs и ряд других. Почему же внимание ученых в большей степени приковано к CRISPR-технологии? В чем ее конкурентное преимущество или преимущества, выгодно отличающие от остальных способов редактирования?
- Действительно, на сегодняшний день создано несколько способов редактирования генома, в том числе, те, которые вы назвали.
Эти методы основаны на использовании специфических эндонуклеазцинковых пальцев ZFNs и эндонуклеазы TAL (Transcriptionactivator-likeeffectornuclease, TALEN). ЭндонуклеазаZFN имеет ДНК-связывающие структуры (они называются домены). Домены «цинкового пальца» распознают последовательность ДНК из 3-х пар оснований. Так, массив из 3-х пальцев будет содержать 9 пар оснований.
В отличие от ZFN, эндонуклеаза TALEN распознает одиночные нуклеотиды: поэтому эта технология гораздо проще в использовании, чем ZFNs. Можно сказать, что TALEN занимает промежуточное положение между ZFN и CRISPR.
Что касается CRISPR, преимущество этого метода редактирования заключается в том, что он опирается на формирование единого РНК-комплекса, вместо распознавания белка/ДНК. Иными словами, для каждого локуса-мишени требуется разработка, экспрессия и проверка совершенно новой пары белков, что значительно ограничивает область применения методов ZFNs и TALENs. Гидовая РНК в CRISPR может ориентироваться на любую последовательность в геноме, что делает эту технологию более эффективной и менее дорогостоящей. Для сравнения, технология TALEN в 200 раз дороже CRISPR и требует нескольких месяцев работы.
- Вы, как и другие ученые, утверждаете, что CRISPR-технология наиболее перспективная, однако и у этого способа редактирования генома есть свои проблемы и недостатки. Какова же «зона действия» CRISPR-технологии. Что она действительно может, а в каких проблемах бессильна помочь? Есть ли какие-то необходимые исходные условия, которые обязательны для эффективности технологии?
- Как любая, технология, CRISPR имеет и свои ограничения.Чтобы ответить на этот вопрос, нужно представлять в общих чертах как работает эта система.
Ученые заметили, что когда бактериальную клетку атакует вирус, она заимствует генетический материал этого вируса и вставляет его в качестве спейсера (вставки) в свой геном. При повторном столкновении этой бактериальной клетки с тем же самым вирусом, она распознает фрагменты генома вируса. Тогда запускается механизм Cas9, входящий в систему CRISPR-Cas9. Его задача – сделать двуцепочечный разрыв в месте, где CRISPR РНК совпадет с фрагментом ДНК вируса. Далее с помощью ферментов репарации ДНК, этот разрыв устраняется.
Однако CRISPR-РНК – это небольшая молекула, длиной в 20 пар оснований. В геноме вируса существует множество участков, где CRISPR РНК может найти для себя подходящий комплементарный участок ДНК, например, не вируса, а той же самой бактерии, значит, по идее, система может быть направлена на собственный геном бактерии. Но этого не происходит, поскольку белку-эффектору (Cas9) недостаточно полного совпадения направляющей гидовой РНК с мишенью, чтобы сделать разрез ДНК. Необходимо соблюсти одно очень важное условие: к мишени должна прилегать особая короткая последовательность, которая указывает белку Cas9, что это не собственный геном, а чужеродный. В CRISPR-кассете, которая состоит из серии повторов и спейсеров, повтор распознается эффекторным белком как «свое». И, если такая же последовательность есть в мишени, она не будет разрезана. А вот чтобы разрезать мишень, к ней должна прилегать какая-то другая последовательность, максимально не похожая на ту, которая имеется в CRISPR кассете.
Такая последовательность называется PAM (protospaceradjacentmotif), она обеспечивает распознавание «свой-чужой». Способность к распознаванию PAM заложена в самом белке-эффекторе Cas9. Это накладывает большие ограничения на CRISPR-Cas9-систему в том смысле, что мы не можем редактировать любые участки генов, а лишь только те, где есть PAM. Поэтому подборка PAM является критично важным условием успешного применения технологии CRISPR в эукариотических клетках. В геноме есть участки ДНК с регулярно повторяющимися нуклеотидами. Геномное редактирование последних может быть затруднено в силу невозможности подобрать соответствующий PAM и возникающими при этом проблемами с доставкой РНК комплекса. Основная проблема технологии – это биоинформатическое предсказание мишеней для направляющих РНК при редактировании генов. Дело в том, что точное узнавание не сводится только к соответствию мишени и РНК, наличию PAM или ошибочной активности эндонуклеазы (off-target активности). Для того чтобы найти хорошую направляющую гидовую РНК для редактирования генома, необходимо учитывать и другие факторы, такие как состояние хроматина, эпигенетические факторы, определяющие транскрипционную активность того или иного гена и другие.
По поводу лечения заболеваний с помощью геномного редактора CRISPR-Cas. Известны заболевания, причиной которых является единичные мутации, небольшие функциональные делеции или инверсии, например, гемофилия, кардиомиопатия и другие. Вылечить такие заболевания с помощью CRISPR возможно. Шизофрению же будет затруднительно вылечить с помощью CRISPR, так как это заболевание определяется множеством генов c собственной системой регуляции, и пока точно неизвестно - каких.
Какие болезни человека могли бы быть первыми кандидатами при терапии CRISPR? Наиболее вероятно лечение сетчатки глаза: в глаз легче вводить генетические конструкции. Мышцы и печень могут быть хорошими кандидатами для терапии с помощью CRISPR. Можно просто сделать укол и ввести небольшое количество «вылеченных» отредактированных клеток. Можно работать с кровью и создавать, например, химерные рецепторы Т-клеток. Сейчас это перспективное направление иммунологии и генной инженерии
- История CRISPR насчитывает уже 3 десятка лет, первые сообщения об этой системе появились еще в 80-ее гг. Так получается, что в истории изучения CRISPR звучат имена китайских, японских и американских исследователей. И складывается впечатление, что российские исследователи не вносили вклад в создание технологии редактирования генома с помощью CRISPR. Так ли это? Каков вклад российских ученых в исследование CRISPR?
- Начало CRISPR было положено еще в 1987 году, когда группа японских ученых во главе с Есидзуми Исино обнаружила первый локус CRISPR. Позже, Франциско Мохика продолжил масштабное изучение CRISPR и обнаружил локусы CRISPR у 20 микроорганизмов, а в 2002 году были открыты гены Cas9, кодирующие соответствующие эндонуклеазы.
Вклад российских ученых в это открытие тоже есть, но он относится не к самому обнаружению CRISPR, а к более позднему этапу - изучению структуры и функциональных особенностей системы. Среди наиболее ярких имен могу назвать Евгения Кунина, окончившего МГУ и получившего научную степень кандидата наук в 1978. В 1991 году он эмигрировал в США, так что его вклад в изучение CRISPR – скорее американская заслуга, а не российская. Кунин занимался вопросом возникновения в ДНК бактерий регулярно повторяющихся групп нуклеотидов и одним из первых задался вопросом: почему участки ДНК между повторами напоминают ДНК вирусов, способных их заразить. Именно Кунину принадлежит гипотеза о происхождении спейсеров. Кстати, в 2016 году он был избран членом национальной академии наук США.
Для того чтобы в научных новостях о достижениях в редактировании геномов мы видели больше фамилий ученых, работающих в Российской Федерации, необходимо создать базу для молекулярно-биологических и генетических исследований не только в Москве и Санкт-Петербурге, но и других городах.
К сожалению, система логистики, доставки реактивов и оборудования на сегодняшний день у нас в стране оставляет желать лучшего. Ну и конечно, нужны хорошие школы подготовки кадров. У нас катастрофически не хватает генетиков, иммунологов, биоинформатиков. Без них сделать что-либо прорывное и фундаментальное практически невозможно.
- По итогам Совета по науке и образованию 2018 г., президент В. Путин«поставил задачу в кратчайшие сроки разработать программу геномных исследований». На каком уровне сегодня исследования и разработки по геномному редактированию у российских ученых и научных школ? Есть ли специальные лаборатории, которые занимаются этой проблемой?
-Действительно, такая инициатива у нашего президента была. Но лично я не очень верю в ее скорую реализацию: в развитие прорывных достижений и применение их в реальной жизни. Слишком много в отечественной науке условностей и бюрократии: зачастую государство выделяет деньги на проекты, которые потом оказываются малоприменимы на практике, не хватает инициативы и харизмы на местах, где проводятся фундаментальные исследования.
Однако упаднические настроения мне тоже чужды.Сегодня в России появляются новые научные школы, в том числе и по геномному редактированию. Научная группа во главе с профессором Севериновым ведет разработки альтернативных эндонуклеаз. Сколтех - хорошая школа для такого рода исследований. В МГУ занимаются геномным редактированием на животных моделях. Есть небольшие лаборатории, где занимаются геномным редактированием на клеточных линиях. Так что исследования в области CRISPR все-таки ведутся и в России, хотя и не на таком уровне, как в США и Китае.
- В одной из статей о CRISPR-технологии, которые я встретила при подготовке к интервью, автор отмечает, что сегодня это самое популярное и престижное направление исследований для молодых генетиков. При этом, говорит он, на самом деле заниматься CRISPR больше не актуально - все фундаментальные открытия в этой области уже сделаны, осталось технологически оптимизировать инструмент. И, значит, рациональнее бросить молодые силы на создание принципиально иного способа редактирования генома. Согласны ли вы с этим утверждением?
- И да, и нет. Фундаментально – да, система есть, она работает. Необходимо совершенствовать ее, чтобы она давала максимальный результат. Необходимо упрощение белкового и каталитического компонентов, повышение избирательности системы, создание более эффективных средств доставки в разные типы клеток и целые организмы. Конечно, новые познания в ходе исследований могут открыть новые «подводные камни», о которых ранее было неизвестно. Так, например, человек регулярно сталкивается с бактериями, содержащими эндонуклеазы Cas. Человеческий организм может просто выработать иммунитет к эффекторным компонентам системы, и белок Cas может быть попросту уничтожен иммунной системой, при этом геномное редактирование станет невозможным. Это может несколько отбросить развитие технологии назад, но ни в коем случае не остановит. Будут придуманы и испытаны новые эндонуклеазы, позволяющие «обмануть» иммунную систему.
Создание же принципиально новых методов редактирования генома потребует большого количества времени, финансовых вложений и высокой концентрации интеллектуальных ресурсов ученых всего мира. Так что я считаю некорректным давать такого рода советы молодым ученым – наука не стоит на месте, и вы найдете себя в любой ее области при условии, что она вам будет интересна.
- Есть очень много информации о том, какие споры происходят вокруг этичности практики редактирования генома. Причем интересно, что консенсуса нет не только среди широкой общественности, но и в самом научном сообществе. В частности, есть информация о том, как статью китайских ученых о редактировании генома эмбрионов не приняли ни в Nature, ни в Science, обосновывая отказ морально-этическими соображениями. Как бы вы оценили, где находится та красная черта (и есть ли она вообще), которую не стоит переходить исследователям в работе с вмешательством в геном?
- Дженифер Дудна, знаменитый ученый, которая внесла огромный вклад в развитие технологии CRISPR, сделала большой доклад-разбор вопроса этичности редактирования генома. Ее главный вывод заключается в том, что развитие технологии невозможно остановить, а значит, необходимо давать разрешение на публикации работ по модификации половой линии.
Что касается редактирования человеческих эмбрионов, то пока это табу. Возможно, пройдет время, и все изменится. В подавляющем большинстве стран, кроме, пожалуй, Китая, боятся этических проблем, связанных с применением CRISPR-технологий. На мой взгляд, эта ситуация напоминает истерию вокруг темы ГМО: все говорят, что это вредно, но никто не говорит - почему. Все мы едим, например, свежие огурчики, выращенные на грядке. А ведь на пачке с семенами было написано F1, то есть только одно поколение. Я к тому, что большинство наших семян являются генетическими гибридами, то есть генно-модифицированными. Но когда мы едим свое с грядки, почему-то вопрос про ГМО мы себе не задаем. То же самое можно сказать и про редактирование генов. Когда речь идет о спасении жизней людей никто не против, а вот эксперименты с эмбрионами – это плохо. Почему? Любое научное открытие может быть направлено во благо или во зло, это сознательный выбор человека. Ведь все мы родились со свободной волей.
Один из аргументов, который любят озвучивать противники CRISPR: ученые, усовершенствовав эту технологию, захотят создать идеального человека. Однако технология получения улучшенных людей вообще находится за пределами того, на что способна CRISPR.
Развитие науки и технологий не остановить, вмешательство в геном идет полным ходом. Пока эта работа ведется на растениях и животных, но и человек в будущем не будет исключением. Иначе как победить рак, наследственные, аутоиммунные, тяжелые вирусные заболевания?
Рано или поздно придется сделать выбор в сторону исследования генома человека и редактирования геномов эмбрионов, а связанные с этим социальные и этические проблемы нужно будет решать параллельно. Я бы не стал здесь проводить никаких красных линий, жизнь и научный прогресс расставят все по своим местам.
-А как вы оцениваете: насколько внедрение CRISPR-технологий в практику медицинской генетики близкое событие? Будет ли эта технология поставлена на поток уже через 3-5 лет или под вопросом ее внедрение даже через 30 лет? И каковы вообще ее перспективы, в частности, на российском рынке?
- Внедрение CRISPR-технологий в практику медицинской генетики, на мой взгляд, не близкое событие. Хотя с момента открытия первого локуса CRISPR прошло более 30 лет, технология редактирования генов эукариот еще «сырая» и нуждается, как я уже сказал выше, в совершенствовании.
Я думаю 3-5 лет – это слишком малый срок, чтобы говорить о том, что данная технология будет поставлена на поток. Это дело будущего, но гораздо более далекого, чем думают оптимисты. Трудно сказать, что будет через 30 лет. Во всяком случае, надеюсь, за этот период человечество научится справляться с такими заболеваниями, которые не подвластны медицине сегодня, а CRISPR станет хорошим инструментом для реализации этой идеи. И еще одна моя надежда: что и наша страна внесет свой весомый вклад в достижение этой цели.
