Последние эксперименты, в которых используется инструмент редактирования генов CRISPR-Cas9 для модификации человеческих эмбрионов, показали, как этот процесс может вносить крупные нежелательные изменения в геном в целевом сайте или рядом с ним.
Новые исследования были опубликованы на сервере препринтов bioRxiv и еще не прошли рецензирование. Они указывают на то, что риск редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9 недооценен. Предыдущие эксперименты показали, что этот инструмент может вызывать генные мутации «далеко от цели». В последних исследованиях были выявлены изменения рядом с целевыми сайтами, которые могут быть пропущены стандартными методами оценки.
«Изменения в целeвых областях генома имеют большее значение, и их будет гораздо труднее устранить», – говорит Гаэтан Бурджо (Gaétan Burgio), генетик Австралийского национального университета в Канберре (Australian National University in Canberra).
Проблемы безопасности – это основа продолжающихся дебатов о том, должны ли ученые редактировать человеческие эмбрионы для предотвращения генетических заболеваний. Данный метод вызывает споры, поскольку создает постоянные изменения в геноме, которые могут передаваться из поколения в поколение. «Если редактирование человеческого эмбриона или зародышевой линии в репродуктивных целях можно было сравнить с космическим полетом, то новые данные эквивалентны взрыву ракеты на стартовой площадке перед взлетом», – говорит Федор Урнов, ученый Калифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley), не принимающий участия в последних исследованиях.
Нежелательные эффекты
Исследователи провели первые эксперименты с использованием CRISPR для редактирования человеческих эмбрионов в 2015 году. С тех пор несколько групп по всему миру продолжили эксперименты, чтобы научиться точечно редактировать гены. Однако такие работы проводятся редко и строго регламентируются.
«Последнее исследование подчеркивает, как мало известно о процессах восстановления ДНК в человеческих эмбрионах после редактирования с помощью CRISPR-Cas9. Нам нужно базовое представление о том, что будет происходить в клетках, прежде чем мы начнем использовать ДНК-энзимы», – говорит биолог-репродуктолог Мэри Герберт (Mary Herbert) из Ньюкаслского университета, Великобритания (Newcastle University, UK).
В первом исследовании, опубликованном в июне, Кэти Ниакан (Kathy Niakan) из Института Фрэнсиса Крика в Лондоне (Francis Crick Institute in London) и ее коллеги использовали CRISPR-Cas9 для создания мутаций в гене POU5F1, задействованном в процессе правильного эмбрионального развития. Из 18 отредактированных эмбрионов у 4 были выявлены нежелательные изменения, затрагивающие большие участки ДНК вблизи гена POU5F1. Они включали перестановки участков ДНК и большие делеции в несколько тысяч нуклеотидов, что намного больше, чем предполагали исследователи, использующие этот метод.
Другая группа, возглавляемая Дитером Эгли (Dieter Egli), биологом Колумбийского университета в Нью-Йорке (Columbia University in the City of New York), изучала эмбрионы, полученные при использовании сперматозоидов с мутацией в гене EYS2, мутация в котором вызывает слепоту. Команда использовала CRISPR-Cas9 для исправления мутации, но у половины протестированных эмбрионов произошла потеря большого сегмента хромосомы, или всей хромосомы, несущей ген EYS.
Третья группа, возглавляемая Шухратом Миталиповым (Shoukhrat Mitalipov), биологом-репродуктологом Орегонского университета здоровья и науки в Портленде (Oregon Health & Science University in Portland), изучала эмбрионы, полученные с использованием сперматозоидов, несущих мутацию, вызывающую заболевание сердца. Было обнаружено, что редактирование затронуло большие области хромосомы, содержащей мутированный ген.
Все исследования проводились только с научной целью, а не с целью переноса и дальнейшего вынашивания беременности. Ведущие авторы трех исследований отказались обсуждать детали своих работ с редакторами научного журнала Nature до публикации статей в рецензируемых журналах.
Непрогнозируемая репарация
Изменения являются результатами процессов репарации ДНК, которые возникают при использовании инструментов редактирования генома. CRISPR-Cas9 использует небольшую цепь РНК для направления фермента Cas9 в сайт в геноме с аналогичной последовательностью. Затем фермент разрезает обе цепи ДНК в указанном месте, а системы восстановления устраняют поломку.
Редактирование происходит во время восстановления: чаще всего клетка устраняет повреждение, используя несовершенный механизм, который может вставлять или удалять небольшое количество нуклеотидов ДНК. Если исследователи применяют шаблонную ДНК, клетка может использовать эту последовательность для исправления разрыва, что приводит к правильному переписыванию последовательности. Но поломки ДНК сами по себе могут вызвать перестановку или потерю большой области хромосомы.
Предыдущая работа с использованием CRISPR на эмбрионах мышей и неэмбриональных клетках человека показала, что редактирование хромосом может вызывать большие нежелательные эффекты. «Важно было провести опыты и с человеческими эмбрионами, потому что разные типы клеток могут по-разному реагировать на редактирование», – говорит Федор Урнов.
Крупные перестройки могли бы быть не выявлены, потому что в предыдущих исследованиях были обнаружены вставки или удаления только нескольких нуклеотидов ДНК. Однако последние исследования указывают на большие делеции и хромосомные перестройки вблизи сайта-мишени. «Это то, что заставит научное сообщество отнестись к проблеме серьезнее, чем сейчас», – говорит Федор Урнов.
Генетические изменения
В трех последних работах рассмотрены различные объяснения того, как возникают изменения ДНК. Команды Дитера Эгли и Кэти Ниакан объясняют изменения ДНК эмбрионов перестройками и большими делециями. Группа Шухрата Миталипова предполагает, что до 40% обнаруженных изменений были вызваны таким феноменом, как генная конверсия, при которой в процессе репарации ДНК происходит копирование последовательности из одной хромосомы для редактирования ее гомолога.
Шухрат Миталипов и его коллеги сообщали об аналогичных результатах в 2017 году, но некоторые исследователи скептически относились к тому, что у эмбрионов могут происходить частые преобразования генов. Они отметили, что материнские и отцовские хромосомы во время конверсии генов не находятся рядом, и что методы анализа, используемые командой для определения конверсии генов, могли выявить другие хромосомные изменения, включая делеции.
Эгли и его коллеги не обнаружили конверсию генов в своих последних исследованиях, а Бурджио подчёркивает, что анализы, используемые в препринте Миталипова, аналогичны тем, которые команда использовала в 2017 году. «Возможно, что разрывы ДНК по-разному репарируются на разных участках хромосомы», – говорит соавтор Миталипова Джин Су Ким, генетик Сеульского национального университета (Seoul National University).
Источник: evogenlab.ru
Научный консультант: Ольга Хрущова
