Почему теряется мышечная функция?
Отсутствующий при МДД белок дистрофин необходим для сохранности скелетных мышц. Если здоровый человек бежит марафон – он повреждает мышцы, но для него это не проблема, потому что тело способно регенерировать мышечную ткань. Это восстановление происходит в несколько шагов. Сначала - воспалительная реакция, помогающая убирать из организма омертвевшие ткани, а затем – восстановительный этап. Поскольку при МДД повреждение мышц происходит постоянно, то и воспаление идет непрерывно. Формируется порочный воспалительный круг, а восстановление мышц не происходит.
У пациентов в скелетных мышцах уровень оксидативного стресса (повреждения клеток в результате окисления, из-за которого люди стареют) очень высок, это приводит к фиброзу. Мышечная ткань замещается рубцовой или жировой. Кроме того, приток крови при использовании мышц снижается, что еще больше усиливает оксидативный стресс и формирование фиброзной ткани. Также у пациентов с МДД отмечается избыток внутриклеточных ионов кальция, что вредит энергостанциям мышц – митохондриям, в результате они не могут производить энергию. Так происходит прогрессирование заболевания и потеря мышечной функции.
Одна из задач терапии МДД состоит в противостоянии воспалению. Снижение воспаления в целом не повлияет на заболевание, но замедлит его прогрессирование. Сегодня исследуется целый ряд препаратов, работающих в перечисленных выше направлениях.
Малые молекулы
- Кортикостероиды (преднизолон и дефлазакорт) подавляют воспаление и замедляют прогрессировани заболевания, благодаря этому потеря способности передвигаться у пациентов наступает позднее. При терапии МДД кортикостероиды используются давно, хотя изначально они разрабатывались для других заболеваний. В США зарегистрирован один препарат-кортикостероид, предназначенный специально для МДД. Но для препаратов этой группы известен ряд побочных эффектов. Сегодня генетики разрабатывают более безопасные модификации, - рассказала профессор, генетик медицинского центра Лейденского университета в Нидерландах Аннемеке Аартсма-Рус.
- Vamorolone (химическая модификация существующих кортикостероидов) находится на второй стадии клинических испытаний в США и Европе. Пока у него результаты многообещающие, но требуются дополнительные исследования.
А вот Edasalonexent – препарат, который изначально показывал хорошие результаты, но на третьей стадии клинических испытаний оказался менее эффективным, чем кортикостероиды. Его исследования прекратились.
Помочь при заболевании также можно, если снизить фиброз. Антиоксидант Idebenone был направлен на снижение оксидативного стресса, однако на третьей стадии клинических испытаний обнаружилось, что терапевтического эффекта у этого препарата нет. Его разработку прекратили.
В США идут испытания Pamrevlumab (anti-CTGF). Этот препарат направлен на ключевой белок в патогенетическом пути. Он тормозит фактор роста соединительной ткани, играющий важную роль в фиброзе.
На третьей стадии клинических испытаний находится и Givinostat. Это эпигенетический препарат, меняющий активность работы различных генов. Когда волокна скелетных мышц настроены на фиброз, в организме производится меньше белков, отвечающих за восстановление мышечной ткани, и больше белков, отвечающих за фиброз. Givinostat производит «перенастройку» и позволяет производить больше «правильных» белков, - добавила эксперт.
Заместительная генная терапия
Чтобы противостоять развитию заболевания, нужно научиться добавлять в мышечные клетки дистрофин. Ученые-генетики рассматривают несколько способов. Например, с помощью добавления в клетку функциональной копии дистрофина. Сделать это при помощи введения здоровой ДНК в организм, к сожалению, невозможно. Поэтому ученые прибегают к вирусному вектору, так как вирусы могут вводить в клетки генетическую информацию. Для этого используют аденоассоциированный вирус (AAV), проникающий из кровотока в клетки скелетных мышц. Однако из-за небольшого размера в него невозможно поместить всю информацию о гене дистрофина, поскольку в геноме человека он самый большой. Поэтому для AAV нужен микродистрофин. В него входят только самые важные части белка и специфичные для работы в мышцах промоторы (начинают работать только в мышцах, а не в других тканях, в которые может попасть AAV). Промотор дает команду запустить синтез микродистрофина. Суть заместительной генной терапии в том, чтобы заменить геном вируса на ген микродистрофина и данный вирус ввести пациентам. Плюс этой терапии в том, что она практически не зависит от мутаций пациента. Из минусов – ограниченная ёмкость вируса, а также то, что дистрофин может экспрессироваться в нецелевых органах.
- На животных (собаках и мышах) этот подход работает и терапевтический эффект наблюдается. Вопрос в том, как это перенести его на человека. Для этого биотехнологам необходимо решить вопрос масштабирования. Мышь весит всего 20 граммов, пациент, конечно, гораздо больше. Представьте, что вам нужно приготовить один литр супа, а затем – 1000 литров. Сразу станет понятно, что нужно больше ингредиентов и кастрюля большего размера. Но она не поместится на плите. Соответственно, чтобы масштабировать, нужно менять весь процесс производства. Конечно, сварить суп гораздо проще, чем создать микродистрофин. Благодаря правильному выбору вируса попадание AAV в скелетные мышцы стало возможным. Необходимо еще помнить об иммунном ответе. Организм видит аденоассоциированный вирус, не понимая, что он полезный и его трогать не нужно. К тому же, если организм уже знаком с этим вирусом, то иммунный ответ будет очень интенсивным, что крайне опасно. Именно поэтому нужно проводить предварительный скрининг, ведь если пациент ранее сталкивался с этим AAV, то использовать этот метод лечения уже нельзя. Микродистрофин экспрессируется скелетными мышцами, но при этом он не полностью функционален. Со временем способность клеток производить микродистрофин будет теряться. Насколько быстро это произойдет? Пока непонятно. Но из-за иммунного ответа мы не сможем повторно лечить пациента аденоассоциированным вирусом, - отметила Аннемеке Аартсма-Рус.
Три компании в мире проводят клинические испытания препаратов на основе AAV: Sarepta, Solid и Pfizer. Sarepta уже пролечили четырех пациентов в возрасте до 7 лет. Они использовали большую дозировку препарата и выяснили, что в 80% мышечных волокон, взятых при биопсии после лечения, содержалось около 74% микродистрофина. Но отмечались и незначительные побочные явления. На короткое время из-за проблем с производством исследование приостанавливалось, но затем испытания возобновили. Сейчас Sarepta проводит плацебо-контролируемое мышечное исследование на 41 пациенте. Его ход и результаты пока неизвестны. Отметим, что FDA рекомендовала препарат к быстрому одобрению, т.е. у Sarepta есть приоритет. В планах у компании – работа с пациентами более взрослого возраста.
Solid пролечили шесть пациентов в возрасте 4-17 лет. При исследованиях использовали четыре дозировки препарата. Оказалось, что при низкой дозировке производится менее 5% дистрофина небольшим количеством мышечных волокон (менее 10%). 50% мышечных волокон производят микродистрофин на низком уровне (5 - 17%). Кроме того, наблюдались серьезные побочные явления, приводившие к госпитализации пациентов (у одного из пациентов даже отказала почка, ему понадобился краткосрочный диализ). Сейчас все пациенты в порядке. Компания дважды приостанавливала исследования, но сейчас они продолжились.
Pfizer работает с 13 пациентами в возрасте 6-12 лет. Компания для трех пациентах использовала половину дозы, что вводила Sarepta, а для 10 пациентов использовала полуторную дозу. Выяснилось, что при высокой дозировке у 50% пациентов уровень дистрофина восстанавливался, но наблюдались побочные явления (отказ почек). Все пациенты восстановились, но это демонстрирует риски при введении больших доз вируса. Сейчас Pfizer готовится к большому плацебо-контролируемому исследованию на 99 пациентах с использованием средней дозировки.
В России сегодня разрабатываются два препарата, работающие на основе заместительной генной терапии. Один из них использует белок утрофин. Это аутосомный аналог гена дистрофина и белок выполняет те же функции, но в эмбриональном или раннем периоде. Почему симптомы МДД проявляются не сразу после рождения, а только спустя несколько лет? Это как раз связано с постепенной заменой утрофина на дистрофин (у пациентов с МДД дистрофин выполнять свои функции не может).
- Утрофин был у всех пациентов с миодистрофией Дюшенна. Теоретически иммунного ответа на него быть не должно, поскольку для пациента это родной белок. Утрофин может быть использован, как вторая линия терапии. Если мы возьмем заместительную генную терапию на основе дистрофина, повторно её использовать скорее всего не получится из-за иммунного ответа. Тогда можно было бы использовать утрофин, но с использованием другого капсида (внешней оболочки вируса) для доставки и другого серотипа AAV. Для заместительной терапии на мышах в составе AAV использована укороченная версия утрофина – микроутрофин. Обнаруживаются следы препарата в скелетных мышцах, мышцах диафрагмы, печени. При других тестах мы видим схожие эффекты с микродистрофином, - поделилась руководитель лаборатории генной терапии «Марлин Биотех», научный сотрудник Лаборатории моделирования и терапии наследственных заболеваний ИБГ РАН, молекулярный биолог Татьяна Егорова.
Как отметила на конференции Татьяна Егорова, существует договоренность между компанией Марлин Биотех и лидером по производству орфанных препаратов России – компанией Генериум. Совместно они планируют наладить производство генных препаратов на основе аденоассоциированных вирусов для клинических испытаний.
- Чтобы начать клинические испытания, нам нужно провести ряд экспериментов на токсичность и безопасность на том материале, который в дальнейшем пойдет в клинические испытания. Невозможно говорить о сроках, которые потребуются для этого. Все зависит от успешности и быстроты наладки производства в России, так как его в нашей стране, к сожалению, на сегодня пока не существует. Мы полностью зависим от западных поставок оборудования и реактивов. При оптимистичном раскладе испытания начнутся в нашей стране в течение нескольких лет,- поделилась Татьяна Егорова.
Терапия на основе исправления стоп-кодона
Еще один вид терапии, разрабатываемый зарубежными генетиками - чтение через стоп-кодон. У человека есть генетический код дистрофина и специальный кодон (сигнал «старт»), подающий организму команду начинать трансляцию. У пациентов с МДД из-за точковой мутации гена появляется ложный «стоп-сигнал» – стоп-кодон, останавливающий синтез белка. В результате получается нефункциональный дистрофин. Генетики работают над соединениями, подавляющими эти остановки. Например, Ataluren позволяет исправить стоп-кодон, считать весь код и полностью произвести белок. Это вещество условно одобрено в Европе еще в 2014 году. Есть свидетельства, что препарат замедляет прогрессирование заболевания, подтверждено, что он безопасен. Но пока нет безоговорочных доказательств эффективности препарата.
- Европейское медицинское агентство лекарственных средств дало ему условное одобрение, и в некоторых странах Ataluren уже назначается. Отмечу, что он работает только на нонсенс-мутациях (они превращают генетический код в нечитаемый). А это только одна небольшая группа пациентов с Дюшенном. Поскольку препарат коммерческий, компания наблюдает, как пациенты себя чувствуют вне испытаний в реальной жизни, и действительно, подтверждается, что прогрессирование заболевания замедляется. Но требуется еще дополнительное плацебо-контролируемое исследование, чтобы убедиться в функциональности получаемого дистрофина, - рассказала Аннемеке Аартсма-Рус.
Редактирование генома: фантастика или возможность?
Новым подходом в терапии миодистрофина Дюшенна является редактирование генома. Пока оно не проходит клинических испытаний, и говорить о его применении в лечении пациентов рано. Попуск экзона и редактирование генома связаны с рамкой считывания. Код у гена дистрофина состоит из 79 экзонов, соединяющихся друг с другом определенным образом. Так как же работает система редактирования генома CRISPR/Cas9? Это GPS-система, навигатор, который сообщает «ножницам» где резать. С их помощью прячется определенный экзон и склеиваются соседние области, благодаря чему восстанавливается рамка считывания генетического кода. В случае с медикаментозной терапией – пациенту нужно постоянно получать лекарства, чтобы пропускался определенный экзон. «Ножницы» на уровне ДНК должны исправить генетический код, чтобы всякий раз при появлении проблемы в организме, она бы автоматически исправлялась.
До пятого экзона считывание идет нормально, а потом – нет. Поскольку код не считывается, то трансляция белка останавливается и производится нефункциональный дистрофин. У пациентов с синдромом Беккера, например, отсутствуют экзоны с 48 по 51. Но 47 экзон может соединиться с 52, значит, считывающая рамка не нарушается и трансляция белка происходит до конца. При этом из-за отсутствия фрагмента гена вырабатывается частично функциональный белок. Но поскольку важные домены белка дистрофина находятся в начале и конце кода, отсутствие середины не очень критично. Если у пациента с Дюшенном отсутствуют экзоны 48-50, то 47 экзон не сможет соединиться с 51, значит, нарушается код. Но 47 экзон мог бы соединиться с 52. Соответственно, в процессе сплайсинга нужно было бы скрыть 51 экзон и тогда рамка считывания гена восстановилась бы. Для этого на животных моделях используют небольшие модифицированные RNA (антисмысловые олигонуклеотиды). Они прячут определенный экзон, и в результате получается частично функциональный белок, похожий на тот, что вырабатывается у пациентов с миодистрофией Беккера.
- Если в кровоток напрямую подать RNA, то через 10 секунд ее уже там не будет. Нужна химическая модификация для повышения стабильности, чтобы она лучше могла присоединяться к целевому экзону и чтобы повысить их усвояемость клетками. Химическая модификация позволит предотвратить выведение RNA с мочой. Самые распространенные - 2-о-метил фосфоротиоат и фосфородиомидат морфолино олигомер. Задумываются над системной доставкой антисмысловых нуклеотидов. Но представьте, как сложно это сделать для 700 мышц? Кроме того, ее невозможно ввести в мышцу сердца. Некоторые говорят о вылечивании с помощью CRISPR. Но это абсолютно не так. Вы с помощью редактирования генома превращаете у пациента белок типа Дюшенна в белок типа Беккера. То есть в частично функциональный белок. Вы не излечиваете пациента. С помощью этого вы лишь можете замедлить прогрессирование заболевания, - сообщила на конференции Аннемеке Аартсма-Рус.
- Минус редактирования генома в том, что он подойдет не для всех пациентов. Для каждого типа мутаций должна быть разработана своя терапия. Из плюсов - для определенных мутаций можно сохранить больше доменов белка по сравнению с микродистрофином. Для некоторых пациентов (но это редкий пул) с дупликацией экзонов можно полностью восстановить дистрофин до нормального типа. К плюсам относится и то, что экспрессия белка идет с естественного промотора. Предполагается, что такая терапия, единожды примененная, будет действовать всю жизнь, в отличие от заместительной генной терапии, - добавила в своем докладе Татьяна Егорова.
Эксперты отмечают, что в редактировании генома важную роль играет время вмешательства. Ведь, если мышечная ткань уже потеряна, никакими препаратами ее восстановить нельзя. Поэтому у человека, прикованного к креслу, по сути ничего не изменится – он по-прежнему будет в кресле. К сожалению, не существует волшебных палочек, способных превратить фиброзную и жировую ткани в мышечную. Однако разработка лекарственных препаратов ведется во всем мире и эксперты уверены, что в ближайшем будущем наметится серьезный поворот в терапии миодистрофии Дюшенна.
