Создание геномов и кодирование новых свойств в синтезированную ДНК

Создание геномов и кодирование новых свойств в синтезированную ДНК

В новом исследовании, представленном в Американской ассоциации содействия развития науки (American Association for the Advancement of Science (AAAS)) в феврале 2020 года, сообщается о создании первого в мире искусственного  бактериального генома с использованием алгоритма цифрового проектирования наряду с синтезом структурных блоков ДНК в крупных масштабах. Этот геном формируется благодаря химическому, а не матричному синтезу. Результаты исследования опубликованы в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.
 139 •
  0
22.02.2020
www.shutterstock.com

Химический синтез генома

В разделе синтетической биологии синтетическая геномика с недавних пор занимает лидирующие позиции. В начале столетия геном полиовируса и бактериофага phiX174 был синтезирован химическим путем, без комплементарной ДНК или РНК-матрицы.

Цифровая революция затронула биологию на базовом уровне, таким образом, появилась возможность секвенирования ДНК, которая помогает специалистам по синтетической биологии прочесть, записать и переписать молекулы ДНК для создания полезных микроорганизмов с помощью компьютерных программ.

Успешное создание вирусных геномов небольшого размера побудило синтезировать более сложные организмы, например, некоторые виды микоплазм. Начиная от нескольких килобаз, геномный синтез начал исчисляться мегабазами, что значительно облегчило разработку лучших стратегий для химического синтеза ДНК, а также для транспортировки генома. С другой стороны, одна-единственная мутация не только порождала путаницу, но и препятствовала инициации транскрипции ДНК.

Построение «золотой середины» разновидности генома

Команда, которой ранее удалось синтезировать геном микоплазмы, впоследствии построила уменьшенную версию одной из этих молекул ДНК, включая только основные гены. Помимо прочего, международная группа из 21 учреждения в настоящее время синтезирует 16-хромосомный геном обычных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. К 2018 году успех составил 40%.

Разработчики сосредоточились главным образом на устранении повторяющихся последовательностей нуклеиновых кислот для тРНК, интронов (промежуточных некодирующих последовательностей) и транспозонов, чтобы более точно заменять гомологичные гены между видами. Они также включили новые сайты loxP, где становится возможной точная и контролируемая вставка генов в определенные сайты. Как только хромосомы дрожжей были полностью синтезированы, ученые шаг за шагом начали стремиться к уменьшению размера генома. Это было необходимо в то время, так как мощный редактор генов CRISPR еще не был доступен.


Избыточность и редактирование кодонов

Примечательно, что из-за избыточности генетического кода существует возможность для разработки триплетов по всему геному. Это связано с тем, что несколько триплетов кодируют одну и ту же аминокислоту. Таким образом, возможным стала перезапись кодонов в целом геноме вирусов, нескольких бактерий и дрожжей. Этот эксперимент выявил нецелесообразность переписывания кода с использованием равнозначных кодонов в некоторых случаях, особенно когда это было близко к 5’ или 3’ концам последовательностей, которые кодировали белки.

Совсем недавно генные кассеты, или автономный набор генных единиц, были переписаны в тандеме с заменой генов во всем геноме, посредством синтеза ДНК с нуля. Однако в настоящее время предстоит проделать еще большую работу, ведь во многих случаях успешно синтезированные гены остаются нефункциональными. Возможно, что некоторые сигналы для транскрипции или трансляции встроены в концы экзонов, и мы действительно в некоторых случаях не знаем, где начинается ген.

Это послужило мотивацией для проведения исследования, в котором ученые ищут пути переписывания генома в больших масштабах, используя равнозначные кодоны, сочетая эту работу с поиском причин ошибок в геноме. Необходимость заключается в «обобщенном высокопроизводительном методе выявления диагностических ошибок», с помощью которого можно оценить переписывание всего генома.

Проект

Исследователи попытались синтезировать уменьшенную или упрощенную версию генома пресноводной бактерии Caulobacter crescentus -2.0 (C. eth-2.0), очень эффективного и восприимчивого модельного организма клеточного цикла. Бактериальный транскриптом, рибосомы и другие измерения доступны в виде детальной модели генома.

Цель состояла в том, чтобы разработать простой подход к методу проектирования-тестирования-сборки, который поможет создать индивидуальный геном, включающий основные функции клетки. В основе этого подхода лежит построение генома химическим методом таким образом, чтобы информация в геноме могла быть проанализирована и содержала данные о существующих генах.

Ход работы

Первоочередной задачей было извлечение необходимых компонентов ДНК из нативной бактерии и их соединение для формирования генома на основе цифровых технологий с сохранением при этом организации и ориентации генов в первозданном виде. Ученые задействовали некоторые маркерные гены, самореплицирующиеся последовательности и последовательность челночных векторов. Это бы обеспечило более «тесную» репликацию и с низким уровнем копирования в этой бактерии в начале процесса.

Ученые столкнулись с препятствием, когда обнаружили, что многие из составляющих ДНК не были доступны из-за ограничений на синтезирование. Позже они решили проверить свою теорию о том, что использование равнозначных кодонов облегчит синтез последовательностей химическим способом, и биологические функции при этом останутся неизменными. Таким образом, была создана оптимизированная конструкция, основанная на предыдущем опыте, с более чем 10 000 изменениями в основаниях ДНК. При этом удалось успешно устранить почти 5700 ограничений синтеза.

Ученые хотели получить ответ на вопрос, позволит ли химический синтез выяснить, насколько точно геном аннотируется и выявляются ли скрытые функции. Они включали более 100 000 замещений оснований внутри экзонов, тем самым заменив около 56% всех кодонов своими синонимами.

По сути, последовательность аминокислот осталась прежней. Тем не менее, все остальные уровни генетической регуляции, включая альтернативные рамки считывания и другие скрытые элементы управления внутри экзонов, были сведены к абсолютному минимуму. Фактически, от 77% до 95% этих элементов были удалены. Это должно было позволить идентифицировать гены, которым для функционирования требуется больше, чем аминокислотная последовательность, с определением того, какие из исправленных генов остаются функциональными. Затем нефункциональные гены должны быть восстановлены, чтобы в конечном итоге получить полностью искусственную клетку с полным набором необходимых функций.

Результат

Исследователи обнаружили, что более 90% генов, кодирующих ферменты, сохраняют функциональные возможности. В итоге более 432 генов оставались функциональными. Около 100 генов перестали функционировать, возможно, из-за неверной аннотации, наличия неизвестных генетических регуляторов, или потому, что они вообще не кодируют белок. Таким образом, этот подход полезен для проверки точности аннотации генома.

Четыре из этих генов были целенаправленно восстановлены, это привело к идентификации важного элемента перед одним из них. В некоторых из них были некодирующие элементы внутри экзонов, что означало, что эти гены были ошибочно аннотированы ранее.

Выводы

Результаты исследования показывают, что, хотя ученые еще не создали живую клетку, они протестировали и нашли подход для синтеза спроектированных генов. Это обещает создать гибкую конструкцию с низкой стоимостью, надежное химическое производство. Самая большая проблема, как правило, заключается не в технических, а в этических и социальных проблемах, которые могут возникнуть.

Источник перевода: www.news-medical.net

Консультанты:
Комментарии для сайта Cackle

Актуальное

Главное


Партнеры

Все партнеры