К муковисцидозу приводит сотни мутаций в гене CFTR, в том числе самая частая в европейских популяциях - F508del. Специалистам лаборатории редактирования генома ФГБНУ «Медикогенетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» в результате ряда экспериментов удалось исправить мутацию в культуре клеток пациентов с муковисцидозом путем геномного редактирования. Эффективность исправления составила 5%, то есть в 5% клеток мутация была исправлена.
- В работе мы использовали иммортализованную линию CFTE29o- и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки больного муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del. Ранее мы опубликовали детальную характеристику этой культуры стволовых клеток , - рассказала заведующая лабораторией редактирования генома ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова», к.м.н. Светлана Смирнихина, - Компоненты CRISPR/Cas9 были внесены в клетки, эффективность коррекции мутации была оценена методом секвенирования следующего поколения (NGS). В культуре CFTE29o- мутацию удалось откорректировать примерно в 3% клеток, тогда как в культуре стволовых клетках пациента – в 5% клеток. Эти результаты хорошо согласуются с мировыми данными, демонстрирующими низкую эффективность коррекции именно этой мутации.
К исследовательской работе подключили Ангелину Ершову, молодого ученого, которая сама имеет диагноз муковисцидоз. Ангелина проходила стажировку в лаборатории редактирования генома ФГБНУ «МГНЦ», она стала донором клеток кожи, участвовала в анализе данных NGS.
Для излечения муковисцидоза предполагается, что необходимо исправить мутацию в 10-15% клеток легких пациента. Низкая эффективности геномного редактирования – общая проблема исследователей всего мира. Данные мировой литературы говорят об эффективности в разных случаях 2 – 5%.
Необходимо проводить дальнейшие исследования, направленные на повышение эффективности доставки компонентов CRISPR/Cas9 в клетки, что позволит повысить эффективность редактирования мутации F508del в гене CFTR.
- У нас есть несколько идей по повышению эффективности редактирования мутации. Самым очевидным решением является отбор и экспансия только редактированных клеток. Если же пытаться повысить эффективность редактирования без селекции клеток, то здесь у нас уже есть наработки по стимулированию гомологичной рекомбинации, по использованию веществ, синхронизирующих клетки в нужные фазы клеточного цикла, когда возможна гомологичная рекомбинация. Кроме того, у нас хорошие результаты по доставке CRISPR-Cas9 в клетки не в виде плазмид, как мы обычно делаем, а в виде рибонуклеопротеиновых комплексов, что, по нашим данным, повышает эффективность коррекции мутаций в несколько раз. В работе у нас есть и другие подходы. Надеемся, что один из этих методов или их комбинация позволят нам увеличить эффективность коррекции мутации F508del в гене CFTR хотя бы до уровня в 15%, - пояснила Светлана Смирнихина.
Работа лаборатории редактирования генома была поддержана, в том числе, грантом РНФ (№17-75-20095).
Источник: Пресс-центр ФГБНУ «МГНЦ»
